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Drosofilia Quantificazione della giunzione neuromuscolare (NMJ)

 
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Drosofilia Quantificazione della giunzione neuromuscolare (NMJ): un metodo per valutare la morfologia e la funzione sinaptica

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- In primo luogo, le larve di Drosophila immunostain con marcatori che evidenziano diversi aspetti dei NMJ o delle giunzioni neuromuscolari. Questa è la regione in cui la fine di un assone del motoneurone contatta un muscolo e la sua morfologia viene utilizzata come lettura della funzione sinaptica.

L'assone termina in diversi rami che formano rigonfiamenti chiamati bouton. I neurotrasmettitori vengono rilasciati dai bouton e causano contrazione muscolare. Le aree di rilascio del neurotrasmettitore sono chiamate zone attive. Qui un marcatore è specifico per una proteina sinaptica che delinea la NMJ, e l'altro marcatore è per una proteina presente nelle zone attive.

Acquisire quindi immagini NMJ utilizzando la microscopia e valutarne quantitativamente la morfologia con un software di analisi delle immagini semi-automatizzato. Applicare una serie preimpostata di comandi software alle immagini. I file di output contengono immagini NMJ analizzate e risultati morfologici. Le caratteristiche misurabili includono il numero e la superficie dei bouton, la lunghezza e il numero di ramo NMJ, il numero di compartimenti NMJ non collegate e il numero di zone attive.

Nell'esempio seguente, analizzeremo la morfologia dei DJ Drosophila macchiati con DLG1, un marcatore postsinaptico, e BRP, un marcatore di zona attivo.

- Per questo protocollo, generare stack di immagini di NMJ e salvarli come singoli file TIFF in cui il canale 1 mostra la colorazione DLG1 o un marcatore simile e il canale 2 mostra la colorazione BRP. Per iniziare, creare proiezioni Z e iperstack dei file di immagine NMJ. Aprire le opzioni del plug-in e selezionare morfometria Nmj Drosophila.

A questo punto, identificare la stringa di file univoca assegnata dal microscopio alla serie di immagini durante la memorizzazione come TIFF. Si trova alla fine del nome dell'immagine. Copiare e incollare la stringa assegnata al piano più basso e al numero di canale nella finestra di impostazione univoca della stringa di file. Selezionare quindi la sottomacro 'Converti in stack' e scegliere la directory o la cartella in cui si trovano le immagini.

Per ogni file di immagine vengono realizzati due nuovi file con lo stack di nomi predefiniti e lo stack flat, seguiti dal nome dell'immagine originale. I file originali possono quindi essere eliminati per risparmiare spazio di archiviazione. Successivamente, dall'interfaccia morfometrica Drosophila NMJ, selezionare la sottomacro DEL ROI definita e scegliere la directory dei file di immagine.

All'apertura della prima proiezione, selezionate lo strumento selezioni a mano libera, quindi utilizzate il mouse per definire un'area contenente un terminale di interesse NMJ completo. Una volta selezionato, fate clic su OK nella finestra terminale definita. Continuate a farlo fino a quando i terminali NMJ non saranno definiti in tutte le proiezioni. La macro avanza automaticamente il processo. Per ogni file di immagine, viene creato un nuovo file con i nomi predefiniti ROI seguito dal nome dell'immagine originale.

Per quantificare le funzionalità nmj, passare innanzitutto all'interfaccia morfometrica Drosophila NMJ e impostare la scala. Ad esempio, se un pixel dell'immagine corrisponde a 0,72 micron, impostare i pixel di scala su 1 e scalare la distanza su 0,072. Selezionare quindi la sottomacro Analizza e, se sono disponibili due immagini di canale, attivare o disattivare Wait. Premere OK e, quando richiesto, selezionare la directory del file di immagine. Il tempo di elaborazione può essere di diversi minuti per sinapsi.

Dopo l'analisi, i nuovi file di immagine per ogni sinapsi analizzata vengono memorizzati nella cartella parentale e le misurazioni quantitative sono nel file dei risultati.txt. Ispezionare tutte le immagini ed escludere le immagini con errori di segmentazione.

Ad esempio, parti del terminale sinaptico potrebbero non essere incluse nel contorno giallo. Parti dello sfondo potrebbero essere incluse nel terminale sinaptico. Una linea di ossatura blu potrebbe estendersi oltre il terminale sinaptico. Potrebbero esserci troppe zone attive oppure alcune zone attive potrebbero non essere rilevate.

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