Дрозофила Нейромышечная развязка (NMJ) Количественная оценка: Метод оценки синаптической морфологии и функции

- Во-первых, личинки иммуностена Дрозофилы с маркерами, которые подчеркивают различные аспекты NMJs или нервно-мышечных соединений. Это область, где окончание аксона моторного нейрона контактирует с мышцей, и его морфология используется как считывание синаптической функции.

Аксон заканчивается в нескольких ветвях, которые образуют выпуклости называется boutons. Нейротрансмиттеры высвобождаются из бутонов и вызывают сокращение мышц. Области нейромедиатора релиз называются активными зонами. Здесь один маркер специфичен для синаптических белков, которые излагают NMJ, а другой маркер для белка присутствует в активных зонах.

Далее приобрети изображения NMJ с помощью микроскопии и количественно оцените их морфологию с помощью полуавтоматического программного обеспечения для анализа изображений. Примените предустановленную серию программных команд к изображениям. Выходные файлы содержат проанализированные изображения NMJ и результаты морфологии.

В следующем примере мы проанализируем морфологию Drosophila NMJs, окрашенных DLG1, постсинаптический маркер, и BRP, активный маркер зоны.

- Для этого протокола, генерировать изображения стеки NMJs и сохранить их в качестве отдельных файлов TIFF, где канал 1 показывает DLG1 окрашивания или аналогичный маркер и канал 2 показывает BRP окрашивания. Для начала, создать проекции и гиперстаки файлов изображения NMJ. Откройте плагин вариантов и выберите Drosophila NMJ морфометрии.

Теперь определите уникальную строку файла, которую микроскоп присвоил серии изображений при хранении их в качестве TIFF. Это будет в конце имени изображения. Копировать и вставлять строку, предоставленную самому низкому номеру плоскости и канала, в уникальное окно настройки строки файла. Затем выберите суб-макро "Преобразовать в стек" и выберите каталог или папку, где находятся изображения.

Для каждого файла изображения, два новых файла сделаны с стека имен по умолчанию и плоский стек, а затем оригинальное название изображения. Исходные файлы могут быть удалены, чтобы сохранить пространство для хранения. Далее, из интерфейса Drosophila NMJ morphometrics, выберите определенный ROI суб-макро и выбрать каталог файла изображения.

По мере открытия первой проекции выберите инструмент для выбора от руки, а затем используйте мышь для определения региона, содержащего полный терминал интереса NMJ. После выбора нажмите OK в определенном окне терминала. Продолжайте делать это до тех пор, пока терминалы NMJ не будут определены во всех проекциях. Макро продвигает процесс автоматически. Для каждого файла изображения один новый файл делается с roi имен по умолчанию, а затем с оригинальным именем изображения.

Для количественной оценки функций NMJ сначала перейдите к интерфейсу морфометрии Drosophila NMJ и установите шкалу. Например, если один пиксель изображения соответствует 0,72 микронам, установите масштаб пикселей до 1 и масштабируйте расстояние до 0,072. Затем выберите суб макроанализ, а если есть два канала изображения, также переключить Wait. Press OK и при подсказке выберите каталог файлов изображения.

После анализа в родительской папке хранятся новые файлы изображений для каждого анализируемого синапса, а количественные измерения находятся в файлах .txt. Проинспектировать все изображения и исключить фотографии с ошибками сегментации.

Например, части синаптического терминала могут не быть включены в желтый контур. Части фона могут быть включены в синаптический терминал.