Drosophila Nöromüsküler Kavşak (NMJ) Nicelemesi: Sinaptik Morfoloji ve fonksiyonu değerlendirmek için bir yöntem

- İlk olarak, NMJ'lerin veya nöromüsküler kavşakların farklı yönlerini vurgulayan belirteçlere sahip immünostain Drosophila larvaları. Bu, bir motor nöron aksonunun sonunun bir kasla temas ettiği ve morfolojisinin sinaptik fonksiyonun okunması olarak kullanıldığı bölgedir.

Akson, bouton adı verilen çıkıntılar oluşturan birkaç dalda sona erer. Nörotransmitterler boutonlardan salınır ve kas kasılmasına neden olur. Nörotransmitter salınımı bölgelerine aktif bölgeler denir. Burada bir belirteç NMJ'yi özetleyen sinaptik bir proteine özgüdür ve diğer belirteç aktif bölgelerde bulunan bir protein içindir.

Daha sonra, mikroskopi kullanarak NMJ görüntülerini alıp yarı otomatik görüntü analiz yazılımı ile morfolojilerini nicel olarak değerlendirin. Görüntülere önceden ayarlanmış bir dizi yazılım komutu uygulayın. Analiz edilen NMJ görüntüleri ve morfoloji sonuçları içeren çıktı dosyaları. Ölçülebilen özellikler arasında boutonların sayısı ve yüzey alanı, NMJ uzunluğu ve dal sayısı, bağlantısız NMJ bölmelerinin sayısı ve aktif bölge sayısı bulunur.

Aşağıdaki örnekte, bir postynaptik işaretleyici olan DLG1 ve aktif bir bölge işaretleyicisi olan BRP ile lekelenmiş Drosophila NMJ'lerin morfolojisini analiz edeceğiz.

- Bu protokol için, NMJ'lerin görüntü yığınlarını oluşturun ve kanal 1'in DLG1 boyama veya benzeri işaretleyiciyi gösterdiği ve kanal 2'nin BRP boyamayı gösterdiği bireysel TIFF dosyaları olarak kaydedin. Başlamak için, NMJ görüntü dosyalarının Z projeksiyonlarını ve hiperstack'lerini oluşturun. Eklenti seçeneklerini açın ve Drosophila NMJ morfometrilerini seçin.

Şimdi, mikroskobun görüntü serisine TIFF olarak depolarken atadığı benzersiz dosya dizesini tanımlayın. Bu, görüntü adının sonunda olacaktır. En düşük düzlem ve kanal numarasına verilen dizeyi kopyalayıp benzersiz dosya dizesi ayar penceresine yapıştırın. Sonra 'Yığına dönüştür' alt makrosunu seçin ve görüntülerin bulunduğu dizini veya klasörü seçin.

Her görüntü dosyası için, varsayılan adlar yığını ve düz yığın ile iki yeni dosya yapılır, ardından orijinal görüntü adı. Orijinal dosyalar daha sonra depolama alanından tasarruf etmek için silinebilir. Sonra, Drosophila NMJ morfometrik arayüzünden, tanımlanan yatırım getirisi alt makrosunu seçin ve görüntü dosyası dizinini seçin.

İlk projeksiyon açılırken, serbest seçim aracını seçin, ardından tam bir NMJ ilgi terminali içeren bir bölge tanımlamak için fareyi kullanın. Seçildikten sonra, tanımlanan terminal penceresinde Tamam'ı tıklatın. NMJ terminalleri tüm projeksiyonlarda tanımlanana kadar bunu yapmaya devam edin. Makro işlemi otomatik olarak ilerletiyor. Her görüntü dosyası için, varsayılan adlar roi ve ardından orijinal görüntü adı ile bir yeni dosya yapılır.

NMJ özelliklerini ölçmek için önce Drosophila NMJ morfometrik arayüzüne gidin ve ölçeği ayarlayın. Örneğin, görüntünün bir pikseli 0,72 mikrona karşılık geliyorsa, ölçek piksellerini 1'e ve ölçek mesafesini 0,072'ye ayarlayın.

Analizden sonra, analiz edilen her sinaps için yeni görüntü dosyaları ebeveyn klasöründe saklanır ve nicel ölçümler sonuçlardadır.txt dosya. Tüm görüntüleri inceleyin ve segmentasyon hataları olan resimleri hariç tutun.

Örneğin, sinaptik terminalin bölümleri sarı anahatta dahil edilmeyebilir. Arka planın bölümleri sinaptik terminale dahil edilebilir. Mavi iskelet çizgisi sinaptik terminalin ötesine uzanabilir. Çok fazla etkin bölge olabilir veya bazı etkin bölgeler algılanmadan kalabilir.