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Zwei-Photonen-Laser-induzierte neuronale Verletzung

 
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Zwei-Photonen-Laser-induzierte neuronale Verletzung: Eine Methode zur Beobachtung der Axondegeneration und Regeneration bei Drosophila Larven

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- Beginnen Sie mit der Montage einer sauberen, anästhesierten Larve unter einer Glasabdeckung rutschen mit dem Kopf nach oben. Als nächstes, setzen Sie den Bereich des Interesses, indem Sie sanft drücken die Abdeckung Schlupf, um die Larve zu rollen und ihre Position anpassen. Verwenden Sie konfokale Bildgebung, um die Larven-Neuralzellen zu lokalisieren. Identifizieren Sie ein bestimmtes Axon auf einem der Ziel-Neuralzellen als Ort für Verletzungen.

Dann setzen Sie das Zielaxon einem Zwei-Photon-Laser mit einer höheren Leistung als für die Bildgebung verwendet, um Schäden zu induzieren. Ein Zwei-Photon-Laser wird aufgrund seiner Fähigkeit verwendet, Schäden innerhalb des lebenden Gewebes zu durchdringen und präzise zu lokalisieren, mit minimalen Schäden am umgebenden Gewebe.

Stoppen Sie die Laser-Exposition sofort, wenn es schäden am Zielneuron, was zu Einerxotomie, oder Abtrennung des Axons. Schließlich Bild der verletzten Neuron, um seine Degeneration und anschließende Regeneration an den gewünschten Zeitpunkten zu sehen.

Im Beispielprotokoll werden wir eine Larve für die Mikroskopie montieren, Schäden an larvensensorischen Neuronen induzieren und die neuronale Regeneration verfolgen.

- Beginnen Sie mit einer Anästhesisierung der Larven. Legen Sie in eine Dunstabzugshaube eine 60-Millimeter-Glasschale in eine 15-Zentimeter-Kunststoff-Petrischale. Dann falten Sie ein Stück Tissuepapier und legen Sie es in die Glasschale. Legen Sie die Trauben-Agar-Platte auf das Gewebe, nachdem der Diethylether hinzugefügt wurde.

Als nächstes legen Sie auf eine Glasrutsche einen Tropfen Halocarbon 27 Öl in die Mitte, und legen Sie einen Fleck Vakuumfett auf jede der vier Ecken. Dann verwenden Sie Zangen, um eine Larve auf die Agarplatte zu übertragen und die Glasschale zu bedecken, um die Larve zu befeuchten. Sobald die Lava aufhört sich zu bewegen, tragen Sie es vorsichtig mit dem Kopf aufrecht auf das Halocarbonöl. Dann legen Sie einen Deckelüberschlag über den Schlitten und drücken Sie ihn sanft.

Als nächstes verwenden Sie sanfte Kraft, um die Abdeckung schlupf zu schieben, um die Zellen zu rollen, die ablated werden, wo der Zwei-Photon-Laser sie am einfachsten treffen wird. Die Position variiert je nachdem, welche Neuronen anvisiert werden. Jetzt sichern Sie die Montage auf der Zwei-Photon-Mikroskop-Bühne und konzentrieren Sie sich auf die Zellen von Interesse mit einem 40-fachen Öl-Immersionsziel.

Wechseln Sie in die Software in den Scan-Modus und laden Sie das gespeicherte Protokoll. Stellen Sie sicher, dass das Loch den ganzen Weg geöffnet ist. Dann, im Live-Modus, erhalten Sie ein gutes Bild der Region von Interesse.

Als nächstes stoppen Sie den Live-Scan, so dass der Zuschneideknopf verfügbar wird. Mit der Crop-Funktion, passen Sie das Scan-Fenster, um den Zielbereich auf nur die prospektive Stelle der Verletzung zu konzentrieren. Dann öffnen Sie ein neues Bildgebungsfenster. Jetzt reduzieren Sie die Scan-Geschwindigkeit und erhöhen Sie die Laser-Intensität. Dann schalten Sie die kontinuierliche Taste zu starten und stoppen Sie den Scan. Beobachten Sie sorgfältig. Sobald es eine drastische Erhöhung der Fluoreszenz, beenden Sie den Scan.

Wechseln Sie als Nächstes zurück zum ursprünglichen Bildfenster, wählen Sie den Live-Modus aus, und suchen Sie den Bereich, der gerade zum Ziel war, indem Sie den Fokus anpassen.

- Ein guter Hinweis auf eine erfolgreiche Verletzung ist das Auftreten eines kleinen Kraters, ringartige Struktur oder lokalisierter Trümmer direkt an der Unfallstelle. Wenn die Laserleistung zu hoch wäre, wäre ein großer beschädigter Bereich sichtbar, der tödlich sein kann.

- Entfernen Sie nun vorsichtig den Deckelschlupf, und übertragen Sie die verletzte Larve auf eine neue Platte mit Hefepaste. Legen Sie die Platte in eine 60-Millimeter-Schale zusammen mit einem Propionsäure-getränkten Gewebe. Dann kehren Sie die Platte auf Kultivierungstemperatur zurück.

Für die nachfolgende Abbildung der Larve nutzen Sie das gespeicherte konfokale Setup und sammeln Z-Stack-Bilder mit einem 25-fachen Objektiv. Achten Sie darauf, den Normalisationspunkt einzubeziehen, damit die Regeneration quantifiziert werden kann.

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