Microinjection des cellules infirmières de Drosophila : une méthode d’accouchement intracellulaire

- Placer un coverslip avec des chambres d’oeufs disséquées sur le stade du microscope. Localiser une chambre d’œuf du stade de développement approprié et l’orientation pour la microinjection. Les chambres d’œufs à un stade moyen à avancé ont un grand jaune d’ovocyte visible, et ceux dans l’orientation correcte sont avec leur axe antérieur-postérieur perpendiculaire à la direction de l’injection.

Les cellules nerveuses de Drosophila sont un groupe de 15 cellules à l’intérieur de la chambre d’œufs chargées de déposer les nutriments et les biomolécules d’origine maternelle dans l’ovocyte en développement. Mettre en place le système de microinjecteur à la pression d’injection et de compensation appropriée pour assurer un volume d’injection et un écoulement extérieur constants. Apportez soigneusement une aiguille capillaire précédemment chargée dans le champ de vision afin que les cellules et l’aiguille soient dans le même plan focal.

S’assurer qu’il n’y a pas d’air emprisonné dans le bout du capillaire et qu’il y a un flux continu de la solution. Puis ajuster la position Z de l’objectif pour se concentrer sur la membrane séparant les cellules follicules des cellules infirmières, insérer l’aiguille dans une cellule infirmière et effectuer l’injection.

Le protocole suivant démontre la microinjection des cellules infirmières de Drosophila avec des sondes oligonucléotides fluorescentes, appelées balises moléculaires, contre les transcriptions d’ARNm fournies par la mère pour l’imagerie cellulaire vivante.

- Pour la microinjection moléculaire de balise, sélectionnez l’objectif d’huile de 40x et montez un glissement de couverture avec la chambre d’oeuf disséquée sur le stade de microscope. Localisez une chambre d’oeuf au stade développemental moyen à tardif qui est correctement orientée pour la microinjection, puis installez un microinjecteur avec les pressions appropriées d’injection et de compensation.

À l’aide du joystick du micromanipulateur, abaissez doucement une aiguille chargée d’un microlitre de solution de balise moléculaire dans la goutte d’huile. Amenez la pointe au point vers la périphérie du champ de vision. Effectuez une fonction propre pour enlever l’air de la pointe de l’aiguille et pour s’assurer qu’il y a écoulement de l’aiguille et amener l’aiguille à la position de la maison.

Concentrez-vous sur la chambre d’œuf à microinjecter et remettre l’aiguille au point près du bord de la chambre d’œuf. Effectuez un ajustement fin de la position Z de l’objectif de sorte que la membrane séparant les cellules follicules des cellules infirmières soit au point. Insérez l’aiguille dans une cellule infirmière pour l’injection des balises moléculaires sur une période de deux à cinq secondes.

- Pour assurer le succès reproductible de la microinjection, concentrez-vous soigneusement sur la membrane séparant les cellules follicules et les cellules infirmières qui seront injectées, tout en mettant la pointe de l’aiguille au point avec le micromanipulateur.

- Lorsque toutes les balises moléculaires ont été injectées, retirez doucement l’aiguille et rétractez-la à la position de la maison. Changez l’objectif au grossissement souhaité pour l’acquisition d’image, puis concentrez-vous sur la chambre d’oeufs sous le nouvel objectif et commencez l’acquisition d’image.