Microiniezione di cellule infermiere Drosophila: un metodo di consegna intracellulare

- Posizionare una coverlip con camere d'uovo sezionate sullo stadio del microscopio. Individuare una camera uovo dello stadio di sviluppo appropriato e l'orientamento per la microiniezione. Le camere delle uova a metà o tardiva hanno un grande tuorlo oocita visibile e quelle con l'orientamento corretto sono con il loro asse anteriore-posteriore perpendicolare alla direzione di iniezione.

Le cellule nervose Drosophila sono un gruppo di 15 cellule all'interno della camera delle uova responsabili del deposito di nutrienti e biomolecole di derivazione materna nell'ovocita in via di sviluppo. Impostare il sistema di microiniettore all'appropriata pressione di iniezione e compensazione per garantire un volume di iniezione e un flusso di entrata costanti. Portare con attenzione un ago capillare precedentemente caricato nel campo visivo in modo che le cellule e l'ago si trovano nello stesso piano focale.

Assicurarsi che non vi sia aria intrappolata nella punta del capillare e che vi sia un flusso continuo della soluzione. Quindi regolare la posizione Z dell'obiettivo per concentrarsi sulla membrana che separa le cellule follicolari dalle cellule del follicolo, inserire l'ago in una cella di infermiere ed eseguire l'iniezione.

Il seguente protocollo dimostra la microiniezione di cellule infermiere Drosophila con sonde oligonucleotidi fluorescenti, chiamate fari molecolari, contro le trascrizioni di mRNA con contributo materno per l'imaging di cellule vive.

- Per la microiniezione a faro molecolare, selezionare l'obiettivo dell'olio 40x e montare uno scivolo di copertura con la camera dell'uovo sezionata sullo stadio del microscopio. Individuare una camera di uovo nella fase di sviluppo medio-tardiva correttamente orientata per la microiniezione, quindi impostare un microiniettore con le pressioni di iniezione e compensazione appropriate.

Utilizzando il joystick del micromanipolatore, abbassare delicatamente un ago caricato con un microlitro di soluzione di faro molecolare nella goccia d'olio. Portare la punta a fuoco verso la periferia del campo visivo. Svolgere una funzione pulita per rimuovere l'aria dalla punta dell'ago e assicurarsi che vi sia flusso dall'ago e portare l'ago nella posizione di casa.

Concentrarsi sulla camera delle uova da microiniettare e riportare l'ago a fuoco vicino al bordo della camera delle uova. Eseguire una regolazione fine della posizione Z dell&omito in modo che la membrana che separa le cellule follicolari dalle cellule del vivaio sia a fuoco. Inserire l&<3>;ago in una cella di infermiere per l&;iniezione dei fari molecolari per un periodo di due o cinque secondi.

- Per garantire il successo della microiniezione riproducibile, concentrarsi attentamente sulla membrana che separa le cellule follicolari e le cellule infermiere che verranno iniettate, mettendo a fuoco la punta dell'ago con il micromanipolatore.

- Quando tutti i fari molecolari sono stati iniettati, rimuovere delicatamente l'ago e ritrarlo nella posizione di casa. Modificare l'obiettivo con l'ingrandimento desiderato per l'acquisizione dell'immagine, quindi concentrarsi sulla camera delle uova sotto il nuovo obiettivo e iniziare l'acquisizione dell'immagine.