Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- عندما تتطور الأجنة المحقونة إلى البالغين G0 ، عبر جميع الذباب الفردي إلى مخزونات موازنة مناسبة لتوسيع الخطوط المحتملة لتحرير F1 CRISPR وتكون قادرة على تتبع ميراث التعديل الجينومي.
لاستخراج الحمض النووي الجينومي، سحق الذبابة بطرف ماصة يحتوي على عازل الاستخراج.
الآن بعد أن أصبح الحمض النووي متاحا ، انتقل إلى فحص PCR . على سبيل المثال ، استخدم التمهيديات المصممة لتضخيم منطقة تتضمن التسلسل الجديد.
- عندما nos-Cas9 الأجنة حقن سابقا مع كل من دليل RNA التعبير plasmid والمتبرع استبدال تتطور إلى البالغين، عبر G0 الذباب بشكل فردي لموازن الذباب من خط مناسب لل allele المستهدفة. تخدير ذرية F1 من كل صليب G0 على لوحة ثاني أكسيد الكربون واختيار عشوائيا 10 إلى 20 الذكور تحت المجهر ستيريو.
عندما تفقس يرقات F2 ، اختر الأب F1 من كل صليب. استخراج الحمض النووي الجينومي عن طريق سحق كل ذبابة لمدة 10 إلى 15 ثانية مع طرف ماصة يحتوي على 50 ميكرولتر من عازلة السحق دون الاستغناء عن العازلة.
احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 20 إلى 30 دقيقة. بعد الحضانة، ضع الأنابيب في كتلة الحرارة 95 درجة مئوية لمدة 1 إلى 2 دقيقة لتثبيط البروتين K. بعد الغزل إلى أسفل لمدة 5 دقائق في 10،000 مرة ز، وتخزين إعداد في 4 درجات مئوية لمزيد من تحليل PCR.
إجراء ثلاث خطوات PCR الشاشات القائمة باستخدام التمهيديات إلى الأمام 1 وعكس 1 إلى الشاشة لوجود الإدراج أو الاستبدال.
- الحفاظ على خطوط الطيران مع تقرير التنمية البشرية نهايات التدريجي المؤكدة وإنشاء مخزونات التوازن من الجيل F2. خارج عبر الذباب موازن مرة أخرى لإزالة أي طفرات غير مقصودة على الكروموسومات الأخرى.
