基因组修饰筛选：在果蝇中识别CRISPR生成突变体的方法

-当注射胚胎发育成G0成人时，将所有单个苍蝇交叉到合适的平衡器库存，以扩大潜在的F1 CRISPR编辑线，并能够跟踪基因组修饰的继承。 然后，交叉随机选择的F1单雄到合适的平衡女，以便能够恢复后代，如果F1男性是积极的突变。一旦交叉，将F1雄性转移到管子上进行筛选。

为了提取基因组DNA，用含有提取缓冲器的移液器尖端挤压苍蝇。一旦组织被分解，就会弹出液体。提取缓冲液中含有蛋白酶K，一种酶，可以消化样品中的蛋白质，并被高温激活。

现在，DNA是可访问的，继续PCR筛选。 例如，使用旨在放大包含新序列的区域的引物。只有在修改的情况下，才会将第二个引物绑定并放大PCR 产品。 在示例中，我们将看到由PCR 培育和筛选苍蝇以插入一个交易激活序列，以取代无分支基因的第一个出例。

-当nos-Cas9胚胎以前同时注射指南 RNA 表达质粒和替代捐赠者发育成成人时，交叉 G0苍蝇单独从适合目标等位基因的线向平衡器飞行。麻醉每个 G1 后代在二氧化碳垫上交叉，在立体显微镜下随机挑选10至20名男性。 从适合目标等位基因的线中将每个选定的男性单独交叉到平衡器女性。

当F2幼虫孵化时，从每个十字架上挑选F1之父。通过将每只苍蝇压扁10至15秒提取基因组DNA，用装有50微升挤压缓冲器的移液器尖端，无需分配缓冲区。 然后，将剩余的缓冲区分配到管中并混合均好。

在37摄氏度下孵化20至30分钟。孵化后，将管子置于95摄氏度的热块中1至2分钟，以灭活蛋白酶K。在10，000倍g下旋转5分钟后，将制剂储存在4摄氏度，以进一步进行PCR分析。

使用引物向前1和反向 1 执行基于三步PCR 的屏幕，以筛选插入或替换是否存在。使用前置2 和反向 2 引物执行 PCR，以验证来自三个主要区域的插入或替换。使用引物 M13F 执行 PCR，然后倒转 3 以检查最终的 HDR。

- 保持飞行线与确认的结束 HDR和建立平衡库存从F2 一代。出交叉平衡器再次飞行，以消除其他染色体上的任何意外突变。