Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- Når injicerede embryoner udvikler sig til G0-voksne, skal du krydse alle individuelle fluer til egnede balancerlagre for at udvide potentielle F1 CRISPR-redigerede linjer og være i stand til at spore arven efter den genomiske modifikation.
For at udtrække genomisk DNA skal du klemme fluen med en pipettespids, der indeholder ekstraktionsbuffer. Når vævet er brudt ned, skal væsken skubbes ud. Ekstraktionsbufferen indeholder proteinase K, et enzym, der fordøjer proteiner i prøven og inaktiveres ved høj varme.
Nu, hvor DNA er tilgængeligt, skal du gå videre til PCR-screening. Brug for eksempel primere designet til at forstærke en region, der inkluderer den nye sekvens. Kun i nærværelse af modifikationen vil den anden primerbinding og et PCR-produkt blive forstærket. I eksemplet vil vi se fluer blive opdrættet og screenet af PCR til indsættelse af en transaktiveringssekvens, der erstatter den første exon af det branchless gen.
- Når nos-Cas9 embryoner, der tidligere er injiceret med både det vejledende RNA-udtryk plasmid og erstatningsdonoren, udvikler sig til voksne, krydser G0 individuelt for at balancere fluer fra en linje, der passer til den målrettede allele.
Når F2 larverne lukker, skal du vælge F1-faderen fra hvert kryds. Udtræk genomisk DNA ved at klemme hver flue i 10 til 15 sekunder med en pipettespids, der indeholder 50 mikroliter squishing buffer uden at dispensere bufferen. Derefter dispenseres den resterende buffer i røret og blandes godt.
Inkuber ved 37 grader Celsius i 20 til 30 minutter. Efter inkubationen skal rørene placeres i 95 grader Celsius varmeblok i 1 til 2 minutter for at inaktivere proteinase K. Efter spinding ned i 5 minutter ved 10.000 gange g skal præparatet opbevares ved 4 grader Celsius for yderligere PCR-analyse.
Udfør tretrins PCR-baserede skærme ved hjælp af primere fremad 1 og omvendt 1 for at screene for eksistensen af indsættelsen eller udskiftningen. Udfør PCR ved hjælp af fremad 2 og omvendt 2 primere for at kontrollere indsættelsen eller udskiftningen fra tre prime region. Udfør PCR ved hjælp af primere M13F og omvendt 3 for at kontrollere ends-in HDR.
- Hold fluelinjerne med den bekræftede ends-out HDR og etablere balance lagre fra F2 generation. Ud krydse balancer flyver igen for at fjerne eventuelle utilsigtede mutationer på andre kromosomer.
