Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- Wanneer geïnjecteerde embryo's zich ontwikkelen tot G0-volwassenen, kruis dan alle individuele vliegen naar geschikte balancerbestanden om potentiële F1 CRISPR-bewerkte lijnen uit te breiden en de overerving van de genomische modificatie te kunnen volgen. Kruis vervolgens willekeurig gekozen F1-mannetjes naar geschikte balancer-vrouwtjes om nakomelingen te kunnen herstellen als een F1-mannetje positief is voor de mutatie. Zodra het kruis is genomen, brengt u het F1-mannetje over naar een buis voor screening.
Om genomisch DNA te extraheren, moet u de vlieg verp hieronder zetten met een pipetpunt met extractiebuffer. Zodra het weefsel is afgebroken, moet u de vloeistof uitwerpen. De extractiebuffer bevat proteïnase K, een enzym dat eiwitten in het monster verteert en wordt geactiveerd door hoge hitte.
Nu DNA toegankelijk is, gaat u verder met PCR-screening. Gebruik bijvoorbeeld primers die zijn ontworpen om een gebied te versterken dat de nieuwe reeks omvat. Alleen in aanwezigheid van de wijziging zal de tweede primer binden en een PCR-product worden versterkt. In het voorbeeld zullen we zien dat vliegen worden gefokt en gescreend door PCR voor het invoegen van een transactiveringssequentie ter vervanging van de eerste exon van het takloze gen.
- Wanneer nos-Cas9 embryo's die eerder zijn geïnjecteerd met zowel de guide RNA-expressie plasmide als de vervangende donor zich ontwikkelen tot volwassenen, kruist U G0-vliegen individueel om te balanceren vanaf een lijn die geschikt is voor het beoogde allel. Verdoof de F1-nakomelingen van elk G0-kruis op een koolstofdioxidepad en kies willekeurig 10 tot 20 mannetjes onder een stereomicroscoop. Kruis elk geselecteerd mannetje individueel naar een balancervrouwtje uit een lijn die geschikt is voor het beoogde allel.
Wanneer de F2-larven uitkomen, plukt u de F1-vader uit elk kruis. Haal genomisch DNA door elke vlieg 10 tot 15 seconden te verprijzen met een pipetpunt met 50 microliters squishingbuffer zonder de buffer te doseren. Verdeel vervolgens de resterende buffer in de buis en meng goed.
Incubeer gedurende 20 tot 30 minuten op 37 graden Celsius. Na de incubatie plaatst u de buizen 1 tot 2 minuten in een hitteblok van 95 graden Celsius om het proteïnase K te inactiveren. Na 5 minuten op 10.000 keer g te hebben gedraaid, bewaart u het preparaat op 4 graden Celsius voor verdere PCR-analyse.
Voer pcr-schermen in drie stappen uit met behulp van primers vooruit 1 en achteruit 1 om te screenen op het bestaan van de invoeging of vervanging. Voer PCR uit met voorwaartse 2 en reverse 2 primers om de invoeging of vervanging vanuit drie priemregio's te verifiëren. Voer PCR uit met primers M13F en reverse 3 om ends-in HDR te controleren.
- Houd de vlieglijnen met de bevestigde ends-out HDR en stel balansvoorraden van de F2-generatie vast. Uit kruist de balancer opnieuw om onbedoelde mutaties op andere chromosomen te verwijderen.
