Encyclopedia of Experiments: Biology
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- Lorsque les embryons injectés se développent en adultes G0, croisez toutes les mouches individuelles vers des stocks d’équilibreurs appropriés afin d’élargir les lignées potentielles éditées par le BAC ET DEC et de pouvoir suivre l’héritage de la modification génomique. Ensuite, croisez les mâles célibataires F1 choisis au hasard vers des femelles érables appropriées pour pouvoir récupérer la progéniture si un mâle F1 est positif à la mutation. Une fois que la croix a été prise, transférez le mâle F1 dans un tube pour le dépistage.
Pour extraire l’ADN génomique, squish la mouche avec une pointe pipette contenant tampon d’extraction. Une fois que le tissu est décomposé, éjecter le liquide. Le tampon d’extraction contient proteinase K, une enzyme qui digère les protéines dans l’échantillon et est inactivé par une chaleur élevée.
Maintenant que l’ADN est accessible, procédez au criblage pcr. Par exemple, utilisez des amorces conçues pour amplifier une région qui inclut la nouvelle séquence. Ce n’est qu’en présence de la modification que la deuxième amorce se liera et qu’un produit PCR sera amplifié. Dans l’exemple, nous verrons des mouches être élevées et examinées par PCR pour l’insertion d’une séquence de transactivation remplaçant le premier exon du gène sans branches.
- Lorsque nos-Cas9 embryons précédemment injectés avec le plasmide d’expression d’ARN guide et le donneur de remplacement se développent en adultes, croix G0 vole individuellement pour équilibrer les mouches à partir d’une ligne appropriée pour l’allèle ciblé. Anesthésier la progéniture F1 de chaque croix G0 sur un tampon de dioxyde de carbone et choisir au hasard 10 à 20 mâles sous un microscope stéréo. Individuellement traverser chaque mâle sélectionné à une femelle ténue à partir d’une ligne appropriée pour l’allèle ciblé.
Lorsque les larves de F2 éclosent, choisissez le père F1 de chaque croix. Extraire l’ADN génomique en squishing chaque mouche pendant 10 à 15 secondes avec une pointe pipette contenant 50 microlitres de tampon squishing sans distribuer le tampon. Puis, distribuer le tampon restant dans le tube et bien mélanger.
Incuber à 37 degrés Celsius pendant 20 à 30 minutes. Après l’incubation, placer les tubes dans un bloc thermique de 95 degrés Celsius pendant 1 à 2 minutes pour inactiver la proteinase K. Après avoir tourné vers le bas pendant 5 minutes à 10 000 fois g, conserver la préparation à 4 degrés Celsius pour une analyse pcr plus poussée.
Effectuez des écrans PCR en trois étapes à l’aide d’amorces vers l’avant 1 et inversez 1 pour vérifier l’existence de l’insertion ou du remplacement. Effectuez pcr en utilisant l’avant 2 et inversez 2 amorces pour vérifier l’insertion ou le remplacement de trois régions principales. Effectuer PCR à l’aide d’amorceS M13F et inverser 3 pour vérifier les extrémités dans HDR.
- Gardez les lignes de mouche avec le HDR de fin confirmée et établissez des stocks d’équilibre de la génération F2. Out traverser l' équilibreur vole à nouveau pour enlever toutes les mutations involontaires sur d’autres chromosomes.
