Encyclopedia of Experiments: Biology
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- 주사배가 G0 성인으로 발전하면, 모든 개별 파리를 적당한 밸런서 주식으로 건너잠재적인 F1 CRISPR 편집 선을 확장하고 유전체 수정의 상속을 추적할 수 있습니다.
유전체 DNA를 추출하기 위해 추출 버퍼를 포함하는 파이펫 팁으로 비행을 분쇄합니다. 조직이 분해되면 추출 버퍼는 단백질 AK를 함유하고 있으며 시료에서 단백질을 소화하고 고열에 의해 비활성화됩니다.
이제 DNA가 PCR 스크리닝으로 진행되었으므로 PCR 스크리닝으로 진행하십시오. 예를 들어, 새로운 서열을 포함하는 영역을 증폭하도록 설계된 프라이머를 사용합니다.
- 이전에 가이드 RNA 발현 플라스미드와 대체 기증자가 성인으로 발전하는 데, 크로스 G0은 개별적으로 비행하여 표적 알레에 적합한 라인에서 날아갑니다.
F2 애벌레가 부화하면 각 십자가에서 F1 아버지를 선택하십시오. 버퍼를 분배하지 않고 50 마이크로리터의 스퀴싱 버퍼가 들어있는 파이펫 팁으로 각 비행을 10~ 15초 동안 스퀴싱하여 게놈 DNA를 추출합니다.
20~30분 동안 섭씨 37도에서 배양하십시오. 인큐베이션에 따라 튜브를 섭씨 95도의 열블록에 넣고 1~2분 동안 10,000회 g에서 5분간 회전한 후, 추가 PCR 분석을 위해 섭씨 4도에 보관하십시오.
프라이머를 사용하여 3단계 PCR 기반 화면을 1번 앞으로 수행하고 삽입 또는 교체의 존재를 검사합니다.
- 확인된 종료 HDR로 플라이 라인을 유지하고 F2 세대의 밸런스 스톡을 설정합니다.
