Screening för genomiska modifieringar: En metod för att identifiera CRISPR-genererade mutanter i Drosophila

- När injicerade embryon utvecklas till G0 vuxna, korsa alla enskilda flugor till lämpliga balanseringslager för att expandera potentiella F1 CRISPR-redigerade linjer och kunna spåra arvet av den genomiska modifieringen.

För att extrahera genomiskt DNA, krossa flugan med en pipettspets som innehåller extraktionsbuffert.

Nu när DNA är tillgängligt, fortsätt till PCR-screening. Använd till exempel primers utformade för att förstärka en region som innehåller den nya sekvensen. Endast i närvaro av modifieringen kommer den andra primerbindningen och en PCR-produkt att förstärkas. I exemplet kommer vi att se flugor uppföddes och screenas av PCR för införande av en transaktiveringssekvens som ersätter den förgrena siglösa genens första exon.

- När nos-Cas9-embryon som tidigare injicerats med både RNA-uttrycket plasmid och ersättningsdonatorn utvecklas till vuxna, korsa G0 flyger individuellt till balanserflugor från en linje som är lämplig för den riktade allelen. Bedöva F1-avkomman från varje G0-kors på en koldioxiddyna och slumpmässigt plocka 10 till 20 män under ett stereomikroskop. Individuellt korsa varje vald hane till en balanserarkvinna från en linje som är lämplig för den riktade allelen.

När F2-larverna kläcks, välj F1-fadern från varje kors. Extrahera genomiskt DNA genom att krossa varje fluga i 10 till 15 sekunder med en pipettspets som innehåller 50 mikroliter squishingbuffert utan att dela ut bufferten.

Inkubera vid 37 grader Celsius i 20 till 30 minuter. Efter inkubationen, placera rören i 95 grader Celsius värmeblock i 1 till 2 minuter för att inaktivera proteinaset K. Efter att ha snurrat ner i 5 minuter vid 10 000 gånger g, lagra preparatet vid 4 grader Celsius för ytterligare PCR-analys.

Utför trestegs PCR-baserade skärmar med primers framåt 1 och backa 1 för att screena för att det ska finnas infogning eller utbyte. Utför PCR med framåt 2 och omvända 2 primers för att verifiera införandet eller utbytet från tre huvudregion. Utför PCR med primers M13F och omvänd 3 för att kontrollera slut-in HDR.

- Håll fluglinjerna med den bekräftade slut-out HDR och upprätta balanslager från F2-generationen.