Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- Begin om te beginnen met het uitdrogen en drogen van een vast monster om de vervorming van het monster te verminderen die wordt veroorzaakt door de verwijdering van gassen en vloeibaar water bij de verminderde werkdruk van conventionele scanningelektronenmicroscopen, SEMs.
Om het monster te dehydrateren, wast u het met toenemende concentraties ethanol in water totdat 100% ethanol is bereikt. Herhaal dit proces vervolgens met een chemisch droogmiddel in ethanol totdat het monster is gewassen met zuiver droogmiddel. Breng het monster en het droogmiddel over in een verdampingsschaal. Bedek het met minimaal extra droogmiddel en laat het 's nachts drogen in een zuurkast.
Monteer vervolgens het voorbereide monster op de bovenkant van een microscoopstub met behulp van koolstoflijmband. Breng ten slotte zilververf aan op de randen van de stomp en vervolgens van de rand van de stomp tot elk van de monsters, om de opbouw van overtollige elektronen te verminderen, wat kan leiden tot ongewenste beeldartefacten.
In dit experiment worden fruitvliegen, Drosophila melanogaster, voorbereid op SEM-analyse met behulp van het droogmiddel HMDS.
- Om Drosophila melanogaster te bereiden, dompelt u verdoofde vliegen gedurende 2 uur onder in 1 milliliter fixitive bij 4 graden Celsius, om ervoor te zorgen dat ze volledig ondergedompeld zijn.
Gebruik een glazen pipet om het fixitieve te verwijderen. Was het vaste Drosophila-monster drie keer in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter met 1 milliliter van 0,1 molaire fosfaatbuffer pH 7,2 bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Gebruik een glazen pipet om elke was te verwijderen, waarbij u voorzichtig bent het monster niet te verwijderen.
Dehydrateer het monster vervolgens in een microfugebuis, in een volume van 1 milliliter, met elk een gesorteerde ethanolreeks gedurende 10 minuten. Gebruik een glazen pipet om elke was te verwijderen, waarbij u erop let dat u het monster niet verwijdert. Bewaar het monster in de 1,5 milliliter microcentrifugebuis met net genoeg 100% ethanol om het te bedekken.
Om de vliegen chemisch te drogen met HMDS, vervangt u eerst de 100% ethanoloplossing door een 1 tot 2 oplossing van HMDS en 100% ethanol gedurende 20 minuten. Vervang vervolgens de oplossing door een 2 tot 1 oplossing van HMDS en 100% ethanol gedurende 20 minuten. Vervang ten slotte deze oplossing gedurende 20 minuten door 100% HMDS en herhaal het proces eenmaal.
Breng het monster, dat zich in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter en HMDS bevindt, over in een wegwerpaluminium weegschaal. Vervang de 100% HMDS door net genoeg verse 100% HMDS om het monster te bedekken. Plaats het monster in de aluminium schaal direct in een chemische zuurkast om te drogen met een los deksel, zoals een doos, om te voorkomen dat er vuil op het monster valt en laat het 12 tot 24 uur drogen.
Om Drosophila label te monteren, labelt u de onderkant van een aluminium montagestub. Gebruik een precisie-pincet om de gedroogde vliegen in de gewenste positie te plaatsen op een koolstoflijmlipje dat aan de bovenkant van een stomp onder een ontleedmicroscoop is bevestigd. Breng zilvergeleidende lijm aan rond de buitenranden van de stubbs.
Gebruik een tandenstoker om de zilververf aan te sluiten op de vliegen, zorg voor geleidbaarheid en zorg ervoor dat de verf niet het gewenste beeldgebied raakt. Plaats de stubs in een stomphouderdoos. En plaats vervolgens de open stomphouderdoos in een desiccator en laat de zilververf minstens drie uur drogen.
