Essiccazione chimica: Preparazione biologica del campione per la microscopia elettronica a scansione (SEM)

- Per iniziare, iniziare disidratando e asciugando un campione fisso per ridurre la distorsione del campione causata dalla rimozione di gas e acqua liquida alla ridotta pressione operativa dei microscopi elettronici a scansione convenzionale, SEM.

Per disidratare il campione, lavarlo con concentrazioni crescenti di etanolo in acqua fino a raggiungere il 100% di etanolo. Quindi ripetere questo processo con un agente essiccante chimico in etanolo fino a quando il campione non viene lavato con puro agente essiccante. Trasferire il campione e l'agente essiccante in un piatto evaporante. Coprirlo con un agente essiccante aggiuntivo minimo e lasciarlo asciugare in una cappa aspirante durante la notte.

Successivamente, montare il campione preparato sulla parte superiore di uno stub del microscopio utilizzando nastro adesivo in carbonio. Infine, applicare la vernice argentata sui bordi dello stub, quindi dal bordo dello stub a ciascuno dei campioni, per ridurre l'accumulo di elettroni in eccesso, che potrebbero causare artefatti dell'immagine indesiderati.

In questo esperimento, i moscerini della frutta, Drosophila melanogaster, sono preparati per l'analisi SEM utilizzando l'agente essiccante HMDS.

- Per preparare Drosophila melanogaster, immergere le mosche anestetizzate in 1 millilitro di fissivo per 2 ore a 4 gradi Celsius, assicurandosi che siano completamente sommerse.

Utilizzare una pipetta di vetro per rimuovere il fissativo. Lavare il campione fisso di Drosophila in un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri tre volte con 1 millilitro di tampone di fosfato molare 0,1 pH 7,2 a temperatura ambiente per 10 minuti. Utilizzare una pipetta di vetro per rimuovere ogni lavaggio, facendo attenzione a non rimuovere il campione.

Quindi disidratare il campione in un tubo di microfugo, in un volume di 1 millilitro, utilizzando una serie di etanolo graduato per 10 minuti ciascuno. Utilizzare una pipetta di vetro per rimuovere ogni lavaggio, facendo attenzione a non rimuovere il campione. Conservare il campione nel tubo microcentrifugo da 1,5 millilitri con appena il 100% di etanolo per coprirlo.

Per eseguire l'essiccazione chimica delle mosche utilizzando HMDS, sostituire prima la soluzione di etanolo al 100% con una soluzione da 1 a 2 di HMDS e 100% di etanolo per 20 minuti. Sostituire quindi la soluzione con una soluzione da 2 a 1 di HMDS e 100% di etanolo per 20 minuti. Infine, sostituire questa soluzione con 100% HMDS per 20 minuti, quindi ripetere il processo una volta.

Trasferire il campione, che si trova in un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri e HMDS, in un piatto monouso di pesatura in alluminio. Sostituire l'HMDS al 100% con un HMDS fresco appena sufficiente al 100% per coprire il campione. Posizionare il campione all'interno della piastra di alluminio direttamente in una cappa chimica per asciugare con un coperchio sciolto, ad esempio una scatola, per evitare che i detriti cadano sul campione e lasciare asciugare per 12-24 ore.

Per montare l'etichetta Drosophila, utilizzare una pinzetta di precisione per posizionare le mosche essiccate nella posizione desiderata su una linguetta adesiva in carbonio fissata nella parte superiore di uno stub al microscopio di sezionazione. Applicare adesivo conduttivo argento intorno ai bordi esterni degli stubb.

Utilizzare uno stuzzicadenti per collegare la vernice argentata alle mosche, garantendo la conducibilità, assicurandosi che la vernice non tocchi l'area di imaging desiderata. Posizionare gli stub in una scatola portatubi. Quindi posizionare la scatola portatubi aperta in un essiccatore e lasciare asciugare la vernice argentata per almeno tre ore.