Kemisk tørring: Biologisk prøvepræparat til scanning af elektronmikroskopi (SEM)

- Til at begynde med skal du starte med at dehydrere og tørre en fast prøve for at reducere prøveforvrængning forårsaget af fjernelse af gasser og flydende vand ved det reducerede driftstryk af konventionelle scanningselektronmikroskoper, SEM'er.

For at dehydrere prøven skal den vaskes med stigende koncentrationer af ethanol i vand, indtil der opnås 100% ethanol. Gentag derefter denne proces med et kemisk tørringsmiddel i ethanol, indtil prøven vaskes med rent tørremiddel.

Derefter monteres den forberedte prøve på toppen af et mikroskop stub ved hjælp af kulstofklæbebånd. Endelig skal du anvende sølvmaling på stubbens kanter, derefter fra kanten af stubben til hver af prøverne for at reducere opbygningen af overskydende elektroner, hvilket kan resultere i uønskede billedartefakter.

I dette eksperiment forberedes frugtfluer, Drosophila melanogaster, til SEM-analyse ved hjælp af tørremidlet HMDS.

- For at forberede Drosophila melanogaster, nedsænke bedøvede fluer i 1 milliliter fiksering i 2 timer ved 4 grader Celsius, og sørg for at de er helt nedsænket.

Brug en glaspipette til at fjerne fikseringsmidlet. Vask den faste Drosophila-prøve i et 1,5 milliliter mikrocentrifugerør tre gange med 1 milliliter 0,1 molarphosphatbuffer pH 7.2 ved stuetemperatur i 10 minutter. Brug en glaspipette til at fjerne hver vask, og pas på ikke at fjerne prøven.

Derefter dehydreres prøven i et mikrofugerør i et volumen på 1 milliliter ved hjælp af en gradueret ethanolserie i 10 minutter hver. Brug en glaspipette til at fjerne hver vask, og pas på ikke at fjerne prøven.

For at udføre kemisk tørring af fluerne ved hjælp af HMDS, Først udskiftes 100% ethanolopløsningen med en 1 til 2 opløsning HMDS og 100% ethanol i 20 minutter.

Prøven overføres, som er i et mikrocentrifugerør på 1,5 milliliter og HMDS i en engangs aluminium vejning parabol. Udskift 100% HMDS med lige nok frisk 100% HMDS til at dække prøven. Placer prøven i aluminium parabol direkte i en kemisk røg hætte til at tørre med et løst låg, såsom en kasse, for at forhindre snavs i at falde på prøven, og lad det tørre i 12 til 24 timer.

For at montere Drosophila mærke bunden af en aluminium montering stub. Brug præcision pincet til at placere de tørrede fluer i den ønskede position på en kulstof lim fane fastgjort til toppen af en stub under en dissekerende mikroskop.

Brug en tandstikker til at forbinde sølvmaling til fluerne, der sikrer ledningsevne, og sørg for, at malingen ikke rører det ønskede billedbehandlingsområde. Placer stubberne i en stubholderboks. Og placer derefter den åbne stubholderboks i en ekssikkator og lad sølvmaling tørre i mindst tre timer.