Kjemisk tørking: Biologisk prøvepreparering for skanning av elektronmikroskopi (SEM)

- Til å begynne med, begynn med å dehydrere og tørke en fast prøve for å redusere prøveforvrengning forårsaket av fjerning av gasser og flytende vann ved redusert driftstrykk av konvensjonelle skanningselektronmikroskop, SEMs.

For å dehydrere prøven, vask den med økende konsentrasjoner av etanol i vann til 100% etanol er nådd. Gjenta deretter denne prosessen med et kjemisk tørkemiddel i etanol til prøven vaskes med rent tørkemiddel. Overfør prøven og tørkemiddelet til en fordampende tallerken. Dekk den med minimal ekstra tørkemiddel og la den tørke i en avtrekkshette over natten.

Monter deretter den forberedte prøven på toppen av et mikroskopstubb ved hjelp av karbonlimbånd. Til slutt, bruk sølvmaling på kantene av stubben, deretter fra kanten av stubben til hver av prøvene, for å redusere oppbyggingen av overflødige elektroner, noe som kan føre til uønskede bildeartefakter.

I dette eksperimentet er fruktfluer, Drosophila melanogaster, forberedt på SEM-analyse ved hjelp av tørkemiddelet HMDS.

- For å forberede Drosophila melanogaster, senk bedøvede fluer i 1 milliliter fikseringsmiddel i 2 timer ved 4 grader Celsius, og sørg for at de er helt nedsenket.

Bruk en glasspipette til å fjerne festemiddelet. Vask den faste Drosophila-prøven i et 1,5 milliliter mikrocentrifugerør tre ganger med 1 milliliter 0,1 molar fosfatbuffer pH 7,2 ved romtemperatur i 10 minutter. Bruk en glasspipette for å fjerne hver vask, og vær forsiktig så du ikke fjerner prøven.

Dehydrer deretter prøven i et mikrofugerør, i et volum på 1 milliliter, ved hjelp av en gradert etanolserie i 10 minutter hver. Bruk en glasspipette for å fjerne hver vask, vær forsiktig så du ikke fjerner prøven. Hold prøven i 1,5 milliliter mikrocentrifugerøret med akkurat nok 100% etanol til å dekke det.

For å utføre kjemisk tørking av fluene ved hjelp av HMDS, Bytt først ut 100% etanoloppløsning med en 1 til 2 løsning av HMDS og 100% etanol i 20 minutter. Erstatt deretter løsningen med en 2 til 1 løsning av HMDS og 100% etanol i 20 minutter. Til slutt erstatter du denne løsningen med 100% HMDS i 20 minutter, og gjentar deretter prosessen en gang.

Overfør prøven, som er i et 1,5 milliliter mikrosenterrør og HMDS, i en engangsvektefat i aluminium. Bytt ut 100 % HMDS med akkurat nok frisk 100 % HMDS til å dekke prøven. Plasser prøven i aluminiumsfatet direkte i en kjemisk avtrekkshette for å tørke med et løst lokk, for eksempel en boks, for å forhindre at rusk faller på prøven, og la den tørke i 12 til 24 timer.

Slik monterer du Drosophila-etiketten på bunnen av en monteringsstussen i aluminium. Bruk presisjons pinsett til å plassere de tørkede fluene i ønsket posisjon på en karbonklebende tapp festet til toppen av en stubbe under et dissekerende mikroskop. Påfør sølvledende lim rundt stubbens ytterkanter.

Bruk en tannpirker til å koble sølvmalingen til fluene, og sørg for konduktivitet, sørg for at malingen ikke berører ønsket bildeområde. Plasser stubbene i en stubholderboks. Og plasser deretter den åpne stubholderboksen i en desiccator og la sølvmalingen tørke i minst tre timer.