Séchage chimique : Préparation d’échantillons biologiques pour la microscopie électronique à balayage (SEM)

- Pour commencer, commencez par déshydrater et sécher un échantillon fixe afin de réduire la distorsion de l’échantillon causée par l’élimination des gaz et de l’eau liquide à la pression de fonctionnement réduite des microscopes électroniques à balayage conventionnel, sems.

Pour déshydrater l’échantillon, lavez-le avec des concentrations croissantes d’éthanol dans l’eau jusqu’à ce qu’il atteigne 100 % d’éthanol. Puis répétez ce processus avec un agent de séchage chimique à l’éthanol jusqu’à ce que l’échantillon soit lavé avec un agent de séchage pur. Transférez l’échantillon et l’agent de séchage dans un plat évaporant. Couvrez-le avec un agent de séchage supplémentaire minimal et laissez-le sécher dans une hotte de fumée pendant la nuit.

Ensuite, montez l’échantillon préparé sur le dessus d’un talon de microscope à l’aide de ruban adhésif en carbone. Enfin, appliquez de la peinture argentée sur les bords du talon, puis du bord du talon à chacun des échantillons, afin de réduire l’accumulation d’électrons excédentaires, ce qui pourrait entraîner des artefacts d’image indésirables.

Dans cette expérience, les mouches des fruits, Drosophila melanogaster, sont préparées pour l’analyse SEM à l’aide de l’agent de séchage HMDS.

- Pour préparer le drosophile melanogaster, plongez les mouches anesthésiées dans 1 millilitre de fixitif pendant 2 heures à 4 degrés Celsius, en vous assurant qu’elles sont complètement submergées.

Utilisez une pipette en verre pour enlever le fixitif. Lavez l’échantillon fixe de Drosophila dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre trois fois avec 1 millilitre de 0,1 molar phosphate tampon pH 7,2 à température ambiante pendant 10 minutes. Utilisez une pipette en verre pour enlever chaque lavage, en prenant soin de ne pas enlever l’échantillon.

Déshydratez ensuite l’échantillon dans un tube de microfuge, dans un volume de 1 millilitre, à l’aide d’une série d’éthanol classé pendant 10 minutes chacun. Utilisez une pipette en verre pour enlever chaque lavage, en prenant soin de ne pas enlever l’échantillon. Gardez l’échantillon dans le tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre avec juste assez d’éthanol à 100 % pour le couvrir.

Pour effectuer le séchage chimique des mouches à l’aide de HMDS, tout d’abord, remplacer la solution 100% éthanol par une solution 1 à 2 de SMD et 100% d’éthanol pendant 20 minutes. Puis remplacer la solution par une solution 2 à 1 de HMDS et 100% éthanol pendant 20 minutes. Enfin, remplacer cette solution par 100% HMDS pendant 20 minutes, puis répéter le processus une fois.

Transférer l’échantillon, qui se trouve dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre et un SMDS, dans un plat de pesage en aluminium jetable. Remplacer l’échantillon dans le HMDS à 100 % par un HMDS 100 % frais pour couvrir l’échantillon. Placez l’échantillon dans le plat en aluminium directement dans un capot de fumée chimique pour sécher avec un couvercle lâche, comme une boîte, pour empêcher les débris de tomber sur l’échantillon et laissez-le sécher pendant 12 à 24 heures.

Pour monter l’étiquette Drosophila, le fond d’un talon de montage en aluminium. Utilisez des pinces de précision pour placer les mouches séchées dans la position désirée sur un onglet adhésif en carbone fixé au sommet d’une talonnement sous un microscope disséquant. Appliquez de l’adhésif conductrice argenté autour des bords extérieurs des stubbs.

Utilisez un cure-dent pour connecter la peinture argentée aux mouches, en assurant la conductivité, en vous assurant que la peinture ne touche pas la zone d’imagerie désirée. Placez les talons dans une boîte porte-talons. Et placez ensuite la boîte ouverte du porte-talons dans un dessicateur et laissez sécher la peinture argentée pendant au moins trois heures.