वयस्क ड्रोसोफिला मक्खियों का इंजेक्शन: यौगिक या लेबल डिलीवरी की एक विधि

- सुई खींचने वाले का उपयोग करके पतली दीवारों वाले ग्लास केशिकाओं को खींचकर पतला इंजेक्शन सुई तैयार करें। एक माइक्रोस्कोप के नीचे सुई पकड़ें और टिप को तोड़ें, यह सुनिश्चित करना कि उद्घाटन वयस्क फ्लाई क्यूटिकल को आवश्यक से अधिक घायल किए बिना छेदने के लिए काफी बड़ा है। एक बाँझ डाई और नमक बफर समाधान के साथ अपनी सुई लोड करके इंजेक्शन की मात्रा को मापें और फिर इसे एक चरण माइक्रोमीटर पर खनिज तेल की एक बूंद पर बाहर निकालें। बाहर निकाली गई बूंद के व्यास को मापने के लिए माइक्रोमीटर पर पैमाने का उपयोग करें, जिसका उपयोग मात्रा तिरस्कृत की गणना करने के लिए किया जा सकता है, और अपने इंजेक्टर को कैलिब्रेट करें तदनुसार सेटिंग्स।

सुई को अपने इंजेक्शन के घोल से लोड करें और उसे इंजेक्शन नोजल पर माउंट करें। ANesthetize अपनी मक्खियों को CO2 के साथ और उन्हें एक CO2 फ्लाई पैड पर व्यवस्थित करें जो उन्हें एनेस्थेटाइज्ड रखेगा। एक बार जब मक्खियां आपके प्रयोग के लिए सही अभिविन्यास में होती हैं, तो इंजेक्शन के साथ आगे बढ़ें। उदाहरण प्रोटोकॉल में, हम वीवो इमेजिंग में फ्लोरोसेइन-लेबल वाले कणों के साथ वयस्क मक्खियों को इंजेक्ट करेंगे।

- सुई खींचने के साथ पतली दीवारों वाले ग्लास केशिकाओं को खींचने के बाद, एक माइक्रोस्कोप के नीचे सुई को पकड़ने के लिए एक माइक्रोमीटर का उपयोग करें और 100 माइक्रोमीटर टिप व्यास के टिप को तोड़ने के लिए नंबर पांच फाइन-पॉइंट स्टेनलेस स्टील चिमटी का उपयोग करें। प्रत्येक फ्लाई में इंजेक्ट किए जाने वाले तरल की मात्रा को मापने के लिए, पीबीएस में बाँझ 5% खाद्य रंग के साथ एक केशिका सुई लोड करें और तरल को 0.01 मिलीमीटर चरण माइक्रोमीटर पर खनिज तेल की एक बूंद पर निष्कासित करें।

पैराफिल्टर के एक छोटे से वर्ग पर 1.6 मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर कणों के 10 माइक्रोलीटर वितरित करें और तरल को सुई में खींचें। सुई को इंजेक्टर नोजल में माउंट करें और फ्लाई पैड पर अपने निर्धारित क्षेत्र के साथ एनेस्थेटाइज्ड मक्खियों को लाइन करें, पैड के सामने की ओर उन्मुख सिर के साथ वेंट्रल साइड अप। पीठ पर इसी क्षेत्रों में शीशियों को रखें और पेट के ऊपरी कोने में मक्खियों को तरल के पांच 100 मिलीसेकंड पंपों के साथ इंजेक्ट करें ताकि कणों के लगभग 10 नैनोलीटर वितरित किए जा सकें। प्रत्येक फ्लाई को उपयुक्त शीशी में स्थानांतरित करें क्योंकि यह इंजेक्शन है, टिप्पण शीशी पर समय।

इसके बाद, 0.4% ट्राइपैन ब्लू समाधान के साथ एक नई सुई लोड करें और वायवीय इंजेक्टर को 'गेटेड' पर सेट करें ताकि हवा के निरंतर प्रवाह को सुई से तरल को बाहर निकालने की अनुमति दी जा सके। शुरुआती इंजेक्शन के 30 मिनट बाद, प्रत्येक फ्लाई पेट को ट्राइपैन ब्लू के साथ तब तक इंजेक्ट करें जब तक कि पेट फुल न हो जाएं और डिटेन्ड न हो जाएं। माइक्रोस्कोप स्लाइड पर मक्खियों को विद्युत टेप वेंट्रल साइड के साथ नीचे रखें, पंखों को टेप तक सुरक्षित करने के लिए फ्लाई के किनारे पर धकेलें। फिर धीरे-धीरे सिर को टेप में धकेल दें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि फ्लाई हिलती नहीं होगी।