Larval Fillet Preparation: Eine Methode zur Visualisierung intakter sensorischer Neuronen und assoziierter epidermaler Zellen

- Um eine Larve für die Filetsektion zu orientieren, legen Sie sie in eine silikonbeschichtete Schale mit kalter Salzsäure und identifizieren ihre dorsalen und ventralen Seiten. Trachealrohre, die entlang ihrer Länge verlaufen, markieren die dorsale Seite, während Bauchdenticlegurte die ventrale Seite identifizieren.

Dann, mit der ventralen Seite nach oben, dehnen Sie vorsichtig die Larve und heften Sie jedes Ende an den Boden der Schale. Diese Position wird die dorsalen Cluster von sensorischen multi-dendritischen Neuronen und die zugehörigen epidermalen Zellen intakt halten, während die Sezierung fortfährt.

Verwenden Sie sezierende Schere entlang der ventralen Mittellinie der Larve zu schneiden. Pin die Nagelhaut auf die Platte, um das Präparat zu glätten und interne Strukturen zu entfernen, um das darunter liegende Muskelgewebe zu offenbaren. Dann entfernen Sie vorsichtig den entsprechenden Muskel, um die Epidermis zu belichten und Zugang zu zuvor verdeckten Neuronen zu erhalten, während ihre dendritische Morphologie erhalten bleibt.

Im Beispielprotokoll werden wir eine detaillierte Demonstration der Larvenfiletvorbereitung und Muskelentfernung sehen, um sensorische Da Neuronen und epidermale Zellen zu sehen.

- Um zu beginnen, fügen Sie genügend kalte Saline zu einer Silikon-Elastomerschale, um die untere Oberfläche zu bedecken. Fügen Sie die Subjektlarve in die Schale und legen Sie sie unter das Stereomikroskop, um eine ordnungsgemäße Platzierung des Lichts zu gewährleisten. Positionieren Sie die Larve mit der ventralen Seite nach oben, die durch die Bauchdenticle Gürtel identifiziert werden kann.

Dehnen Sie die Larve in vorderer-hinterer Richtung, und mit Insektenstiften, pin den Kopf und Schwanz an den Boden der Schale. Mit einem Paar feine Sezieren Schere, schneiden entlang der ventralen Mittellinie der Larve von einem Ende zum anderen. Verteilen Sie die Larve offen und heften Sie das Nagelhautgewebe an den vier Ecken, so dass es flach liegt.

Entfernen Sie mit Zangen die inneren Organe, einschließlich ZNS, Darm und Luftröhre. Passen Sie die Insektenstifte so an, dass das Filet straff, aber nicht maximal gestreckt ist.

Suchen Sie die dorsale Mittellinie der Larve, wo Muskelgewebe fehlt, und positionieren Sie dann eine Zange prong im Inneren dieser Grenze. Schieben Sie die Zange zwischen dem Muskel und Epidermis, wobei darauf geachtet wird, den Kontakt mit der Epidermis zu minimieren.

- Um Schäden an der Epidermis zu minimieren, sezieren Sie mit den flachsten möglichen Zinken. Und versuchen Sie, in kalziumhaltiger Saline zu sezieren.

- Als nächstes ziehen Sie die Zange nach oben, um die Befestigung des Muskels an der Körperwand an einem Ankerpunkt zu brechen. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die verbleibenden Muskelsegmente von Interesse.

Stellen Sie die Insektenstifte so um, dass sie das Larvenfilet maximal in alle Richtungen dehnen.