Larva Fileto Hazırlama: Bozulmamış Duyusal Nöronları ve İlişkili Epidermal Hücreleri Görselleştirmek için Bir Yöntem

- Bir larvayı fileto diseksiyonu için yönlendirmek için, soğuk salin içeren silikon kaplı bir tabağa yerleştirin ve dorsal ve ventral taraflarını tanımlayın. Uzunluğu boyunca uzanan trakeal tüpler sırt tarafını işaretlerken, karın dentikül kemerleri ventral tarafı tanımlar.

Daha sonra, ventral taraf yukarı doğru, larvayı hafifçe uzatın ve her bir ucunu yemeğin dibine sabitlayın. Bu pozisyon, diseksiyon ilerledikçe duyusal çok dendritik nöronların ve ilişkili epidermal hücrelerin dorsal kümelerini sağlam tutacaktır.

Larvaların ventral orta çizgisi boyunca kesmek için diseksiyon makası kullanın. Hazırlığı düzleştirmek ve alttaki kas dokusunu ortaya çıkarmak için iç yapıları çıkarmak için kütikülleri tabağa sabitle. Daha sonra, epidermisi ortaya çıkarmak ve dendritik morfolojilerini korurken daha önce gizlenmiş nöronlara erişmek için uygun kası dikkatlice çıkarın.

Örnek protokolde, duyusal da nöronları ve epidermal hücreleri görüntülemek için larva fileto hazırlama ve kas çıkarmanın ayrıntılı bir gösterimini göreceğiz.

- Başlamak için, silikon bir elastomer kabına alt yüzeyi kaplayacak kadar soğuk salin ekleyin. Konu larvayı yemeğe ekleyin ve stereo mikroskopun altına yerleştirin, ışığın uygun şekilde yerleştirilmesini sağlayın. Larvayı karın dentikül kemerleri tarafından tanımlanabilen ventral tarafı yukarı olacak şekilde konumlandırın.

Larvaları ön-arka yönde uzatın ve böcek pimleri kullanarak, başı ve kuyruğu kabın dibine sabitlayın. Bir çift ince diseksiyon makası ile larvaların ventral orta çizgisi boyunca bir uçtan diğerine kesin. Larvayı açın ve kütikül dokusunu düz olacak şekilde dört köşeye sabitlayın.

Tokaları kullanarak, CNS, bağırsak ve trakea da dahil olmak üzere iç organları çıkarın. Böcek pimlerini fileto gergin olacak şekilde ayarlayın, ancak maksimum şekilde gerilmez.

Kas dokusunun bulunmadığı larvaların dorsal orta çizgisini bulun ve daha sonra bu sınırın iç kısmına bir ön uç yerleştirin.

- Epidermisin hasar görmesini en aza indirmek için, mümkün olan en düz çatallarla parçalara ayırın. Ve kalsiyum içeren salin içinde diseksiyon yapmayı deneyin. Bu, kas ve epidermis arasında boşluk yaratmaya yardımcı olabilir.

- Daha sonra, bir çapa noktasında kasın vücut duvarına bağlanmasını kırmak için forsepsleri yukarı doğru çekin. Kalan kas segmentleri için bu işlemi tekrarlayın.

Larva filetosunu her yöne maksimum şekilde germek için böcek kalemlerini yeniden canlandırın.