Dissection larvaire des glandes lymphatiques : isoler l’organe producteur d’hémocytes de Drosophila

- La glande larvaire larvaire Drosophila melanogaster est responsable de la production d’oursocytes, ou les cellules sanguines, qui circulent dans l’hémolympe larvaire. Pour identifier la glande lymphatique, trouvez d’abord le vaisseau dorsal, ou coeur, qui pompe l’hémolympe dans tout le corps. Suivez le vaisseau dorsal vers la tête jusqu’à ce que vous trouviez le cerveau. La glande lymphatique est une petite structure multi lobée à côté du cerveau, flanquant le vaisseau dorsal.

Pour trouver le lobe primaire, identifiez le plus grand lobe de la glande. Ce lobe contient trois zones, définies par différents stades de développement des hémocytes. La zone médullaire la plus proche du vaisseau dorsal contient des hémocytes immatures, tandis que la zone corticale contient des hémocytes matures. À l’extrémité postérieure du lobe primaire, vous pouvez trouver le centre de signalisation postérieur, composé d’hémocytes spécialisés. Les lobes secondaires et tertiaires sont plus petits et n’ont pas de zones définies.

Pour disséquer la glande lymphatique, vous aurez besoin d’un microscope disséquant, de deux forceps pour manipuler les larves et d’une solution saline tamponnée.

Dans cet exemple, nous disséquerons les glandes lymphatiques pour les utiliser en immunohistochimie.

- Pour commencer la dissection de glande lymphatique, ajoutez 1 millilitre de 1x PBS à 1 puits d’une plaque de 24 puits pour chaque arrangement expérimental à disséquer. Ensuite, à l’aide d’une pipette de transfert jetable, ajouter 1 goutte de 0,1 % de PBST à chaque puits. Placez la plaque à plat sur la glace. Placez un tampon de dissecting propre sur une base stéréomicroscope illuminée. Utilisez une pipette de transfert jetable pour placer une goutte de 0,01 % de PBST sur le tampon.

Transférer une larve à la goutte PBST pour la dissection. Maintenez la lave avec une paire de forceps, côté dorsale vers le haut, à environ 1/4 de longueur de l’extrémité postérieure. Avec la deuxième paire de forceps, prenez la cuticule immédiatement antérieure à la première paire et tirez doucement la cuticule larvaire vers l’antérieur, jusqu’à ce que les crochets de bouche soient exposés.

Relâchez la cuticule et utilisez les deux forceps pour couper la larve en deux. Retirez l’extrémité postérieure de la goutte PBST et jetez-la. Épinglez la cuticule pour plus de stabilité, puis utilisez la deuxième paire de forceps pour saisir les crochets de bouche exposés et les retirer doucement. Cela séparera la cuticule des structures internes.

Garder la main sur les crochets buccaux, enlever soigneusement les structures indésirables, comme les glandes salivaires, le gros corps et l’intestin. Ramasser délicatement le complexe tissulaire disséqué par les crochets de la bouche et le transférer dans un puits de la plaque sur la glace. Répétez la dissection avec autant de larves que désiré, mais ne dépassez pas un temps de dissection de 30 minutes avant de passer à l’étape de fixation.

Pour commencer le montage des tissus, placez une goutte de tampon de montage sur une glissière en verre. En utilisant les crochets buccaux comme poignée, transférez la glande lymphatique à la gouttelette tampon. Espacez les tissus uniformément, en répandant le tampon de montage dans le processus.

Glissez soigneusement une pince des forceps sous le vaisseau dorsal, tirant doucement vers la périphérie du tampon de montage pour dessiner et aplatir la glande lymphatique. Avec un mouvement de sciage, coupez le vaisseau dorsal entre la glande lymphatique et le cerveau. Déplacez le reste des tissus loin de la glande lymphatique au bord externe du tampon.

Prenez un slip de couverture propre et abaissez-le soigneusement sur le tampon de montage. Les glissières sont maintenant prêtes pour l’imagerie ou peuvent être stockées à 4 degrés Celsius jusqu’à ce que nécessaire.