Larva Lenf Bezi Diseksiyonu: Drosophila Hemosit Üreten Organın İzolasyonu

- Drosophila melanogaster larva lenf bezi hemositlerin üretiminden sorumludur, veya larva hemolimfinde dolaşan kan hücreleri. Lenf bezini tanımlamak için, önce dorsal damarı veya vücut boyunca hemolimf pompalayan kalbi bulun. Beyni bulana kadar sırt damarını başa doğru takip edin. Lenf bezi, beynin yanında, sırt damarını kuşatan küçük, çok loblu bir yapıdır.

Birincil lobu bulmak için bezin en büyük lobunun tanımlanması. Bu lob, hemosit gelişiminin farklı aşamaları ile tanımlanan üç bölge içerir. Dorsal damara en yakın medüller bölge olgunlaşmamış hemosit içerirken, kortikal bölge olgun hemositler içerir. Birincil lobun arka ucunda, özel hemositlerden oluşan posterior sinyal merkezini bulabilirsiniz. İkincil ve üçüncül loblar daha küçüktür ve tanımlanmış bölgeleri vardır.

Lenf bezini parçalamak için bir diseksiyon mikroskobuna, larvaları manipüle etmek için iki forsepse ve tamponlanmış bir tuzlu su çözeltisine ihtiyacınız olacaktır.

Bu örnekte, immünhistokimyada kullanılmak üzere lenf bezlerini inceleyeceğiz.

- Lenf bezi diseksiyonu başlamak için, incelenecek her deneysel ayar için 24 kuyulu bir plakanın 1 kuyusuna 1 mililitre 1x PBS ekleyin. Daha sonra, tek kullanımlık bir transfer pipeti kullanarak, her kuyuya% 0.1 PBST'lik 1 damla ekleyin. Plakayı düz bir şekilde buzun üzerine yerleştirin. Işıklı bir stereomikroskop tabanına temiz bir diseksiyon pedi yerleştirin.

Bir larvayı diseksiyon için PBST damlasına aktarın. Lavları bir çift forseps, sırt tarafı yukarı, arka uçtan yaklaşık 1/4 uzunlukta tutun. İkinci forseps çifti ile, kütikülleri hemen ön tarafa alın ve larva kütiküllerini ağız kancaları açığa çıkana kadar yavaşça ön tarafa doğru çekin.

Kütikül bırakın ve larvayı ikiye ayırmak için her iki forseps kullanın. Arka uc uca PBST damlasından çıkarın ve atın. Stabilite için kütikülleri sabitlayın ve ardından maruz kalan ağız kancalarını kapmak ve yavaşça çıkarmak için ikinci forseps çiftini kullanın. Bu, kütikülleri iç yapılardan ayıracaktır.

Ağız kancalarını tutarak, tükürük bezleri, yağ gövdesi ve bağırsak gibi istenmeyen yapıları dikkatlice çıkarın. Kesilen doku kompleksini ağız kancalarından hafifçe alın ve buzdaki plakanın bir kuyusuna aktarın.

Doku montajına başlamak için, bir bardak kaydırağa bir damla montaj tamponu yerleştirin. Ağız kancalarını tutamak olarak kullanarak, lenf bezini tampon damlacığına aktarın.

Derilerin bir maşasını sırt kabının altına dikkatlice kaydırın, lenf bezini çıkarmak ve düzleştirmek için montaj tamponunun çevresine doğru hafifçe çekin. Bir testere hareketiyle, sırt damarını lenf bezi ve beyin arasında kesin. Dokuların geri kalanını lenf bezinden tamponun en dış kenarına doğru hareket ettirin.

Temiz bir kapak kayması alın ve montaj tamponuna dikkatlice diriltin. Slaytlar artık görüntüleme için hazırdır veya ihtiyaç duyulana kadar 4 santigrat derecede saklanabilir.