Larvale lymfklierdissectie: het isoleren van het Drosophila Hemocyt-producerende orgaan

- De Drosophila melanogaster larvale lymfklier is verantwoordelijk voor de productie van hemocyten, of bloedcellen, die circuleren in de larvale hemolymph. Om de lymfeklier te identificeren, vindt u eerst het dorsale vat of hart, dat hemolymph door het hele lichaam pompt. Volg het dorsale vat naar het hoofd totdat u de hersenen vindt. De lymfklier is een kleine, meerlobbige structuur naast de hersenen, die het dorsale vat flankeert.

Om de primaire kwab te vinden, identificeert u de grootste kwab van de klier. Deze kwab bevat drie zones, gedefinieerd door verschillende stadia van hemocytontwikkeling. De medullaire zone die het dichtst bij het dorsale vat ligt, bevat onrijpe hemocyten, terwijl de corticale zone volwassen hemocyten bevat. Aan het achterste uiteinde van de primaire kwab vindt u het achterste signaleringscentrum, samengesteld uit gespecialiseerde hemocyten. De secundaire en tertiaire kwabben zijn kleiner en hebben geen.

Om de lymfeklier te ontleden, heb je een ontleedmicroscoop, twee tangen nodig om de larven te manipuleren en een gebufferde zoutoplossing.

In dit voorbeeld zullen we lymfeklieren ontleden voor gebruik in de immunohistochie.

- Om te beginnen met lymfeklierdissectie, voegt u 1 milliliter 1x PBS toe aan 1 put van een 24-put plaat voor elke experimentele instelling die moet worden ontleed. Voeg vervolgens met behulp van een wegwerptransferpipet 1 druppel van 0,1% PBST toe aan elke put. Plaats de plaat plat op ijs. Plaats een schone ontleedschijf op een verlichte stereomicroscoopbasis. Gebruik een wegwerptransferpipet om een druppel van 0,01% PBS op de pad te plaatsen.

Breng een larve over naar de PBST-druppel voor dissectie. Houd de lava vast met één paar tangen, dorsale kant naar boven, ongeveer 1/4 lengte van het achterste uiteinde. Met het tweede paar tangen grijpt u de nagelriem onmiddellijk vooraan naar het eerste paar en trekt u de larve cuticula voorzichtig naar de voorste, totdat de mondhaken worden blootgesteld.

Laat de nagelriem los en gebruik beide tangen om de larve te bisecten. Verwijder het achterste uiteinde van de PBST-druppel en gooi het weg. Speld de nagelriem vast voor stabiliteit en gebruik vervolgens het tweede paar tangen om de blootgestelde mondhaken te grijpen en ze voorzichtig uit te trekken. Dit zal de nagelriem scheiden van de interne structuren.

Houd de mondhaken vast, verwijder voorzichtig ongewenste structuren, zoals de speekselklieren, het vetlichaam en de darm. Pak voorzichtig het ontlede weefselcomplex bij de mondhaken op en breng het over naar een put van de plaat op ijs. Herhaal de dissectie met zoveel larven als gewenst, maar overschrijd geen dissectietijd van 30 minuten voordat u doorgaat naar de fixatiestap.

Om te beginnen met weefselmontage, plaatst u een druppel montagebuffer op een glazen glijbaan. Gebruik de mondhaken als handvat en breng de lymfeklier over naar de bufferdruppel. Plaats de weefsels gelijkmatig en spreid de montagebuffer in het proces.

Schuif voorzichtig een tang van de tang onder het dorsale vat en trek voorzichtig naar de rand van de montagebuffer om de lymfeklier uit te trekken en af te vlakken. Snijd met een zaagbeweging het rugvat tussen de lymfeklier en de hersenen. Beweeg de rest van de weefsels weg van de lymfeklier naar de buitenste rand van de buffer.

Neem een schone afdekslip en laat deze voorzichtig op de montagebuffer zakken. De dia's zijn nu klaar voor beeldvorming of kunnen tot het nodig is op 4 graden Celsius worden bewaard.