Larve lymfekirtler dissektion: Isolere Drosophila Hemocyte-producerende organ

- Den Drosophila melanogaster larve lymfekirtler er ansvarlig for produktionen af hæmocytter, eller blodlegemer, der cirkulerer i larve hæmolymph. At identificere lymfekirtlen, først finde dorsal fartøj, eller hjerte, som pumper hæmolymph hele kroppen. Følg dorsale fartøj mod hovedet, indtil du finder hjernen. Lymfekirtlen er en lille, multi-fliget struktur ved siden af hjernen, flankerende dorsal fartøj.

For at finde den primære lap skal du identificere den største lap i kirtlen. Denne lap indeholder tre zoner, defineret af forskellige stadier af hæmocyt udvikling. Den medullære zone tættest på dorsal fartøj indeholder umodne hæmocyt, mens den kortikale zone indeholder modne hemocytter. I den bageste ende af den primære lap, kan du finde den bageste signalering center, der består af specialiserede hemocytter. Den sekundære og tertiære lobes er mindre og ikke har definerede zoner.

For at dissekere lymfekirtlen skal du bruge et dissekerende mikroskop, to pincet til at manipulere larverne og en bufferet saltvandsopløsning.

I dette eksempel vil vi dissekere lymfekirtler til brug i immunohistochemistry.

- For at begynde lymfekirtler dissektion, tilsæt 1 milliliter 1x PBS til 1 brønd af en 24-godt plade for hver eksperimentel indstilling, der skal dissekeres. Derefter tilsættes ved hjælp af en engangsoverførselspipette 1 dråbe 0,1% PBST til hver brønd. Placer pladen fladt på is. Placer en ren dissekeringspude på en oplyst stereomikroskopbase. Brug en engangsoverførselspipette til at placere en dråbe på 0,01% PBST på puden.

Overfør en larve til PBST drop for dissektion. Hold lava med et par pincet, dorsal side op, ca 1 / 4 længde fra den bageste ende.

Slip neglebåndet og brug begge pincet til at gennemskrænke larven. Fjern den bageste ende fra PBST drop og kassér. Pin ned neglebåndet for stabilitet og derefter bruge det andet par pincet til at få fat i de udsatte munden kroge og forsigtigt trække dem ud. Dette vil adskille neglebånd fra de interne strukturer.

Hold fat i munden kroge, forsigtigt fjerne uønskede strukturer, såsom spytkirtler, fedt krop, og tarmen. Forsigtigt afhente dissekeret væv kompleks ved munden kroge og overføre det til en brønd af pladen på is. Gentag dissektion med så mange larver som ønsket, men ikke overstiger en 30-minutters dissektion tid, før du går videre til fiksering trin.

For at begynde væv montering, placere en dråbe montering buffer på et glas dias. Brug munden kroge som et håndtag, overføre lymfeknuder til buffer sliplet. Space vævene jævnt, sprede montering buffer i processen.

Skub forsigtigt en tang under dorsalbeholderen, træk forsigtigt mod periferien af monteringsbufferen for at trække ud og flade lymfekirtlen.

Tag et rent dæksel slip og forsigtigt sænke den på montering buffer. Diasene er nu klar til billedbehandling eller kan opbevares ved 4 grader Celsius indtil det er nødvendigt.