Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- Først indsamle fluer på det ønskede udviklingsstadium og placere dem i et sterilt rør. For kun at tælle det indre mikrobiota skal du sterilisere fluernes ydre ved at nedsænke dem i 70% ethanol. For at måle både det indre og eksterne mikrobiota skal du springe over dette steriliseringstrin. Næste, slib fluerne op i et lille volumen bakterievækstmedie ved hjælp af keramiske perler og en vævs homogenisator eller manuelt med en pestle.
Du bør nu have en homogen blanding, der indeholder bakterier, som du kan kultur. Opdrage mængden af homogenatet ved hjælp af flydende bakterielle medium. Udfør serielle fortyndinger af homogenatet og plade et konstant volumen af disse fortyndinger på passende fast vækst medium for dine bakterier. Som bakterierne vokser, kolonier vil danne på pladen. Find fortynding, der har en række 10 til 100 kolonier til at bestemme Colony Forming Units, eller CFU, af prøven.
I eksempelprotokollen vil vi vaccinere sterile fluer med en gnotobiotisk eller defineret bakteriekultur og indsamle og måle CFU'er.
- Brug filterspidser til at overføre 100 mikroliter af natten vækst til en steril mikrofuge rør. Næste, overføre 200 mikroliter af hver kultur til en 96-brønd plade. Fjern prøverne fra biosikkerhed kabinet og centrifuge dem til pellet bakterierne. Efter at en-, to-og fire gange fortyndinger, måle den optiske tæthed eller OD600 på en multi-godt plade læsning spektrofotometer.
Efter at have fået OD600, fjern supernatanten med en pipettespids og brug frisk mMRS til at suspendere pelleten igen. Bland de fortyndede bakteriestammer i lige store forhold for at skabe en multiartscocktail.
For at måle koloniformningsenhederne eller CFU'erne overføres fem fluer til et mikrofugerør på 1,7 milliliter, der indeholder 125 mikroliter keramiske perler og 125 mikroliter mMRS bouillon. Homogeniser fluerne ved hjælp af en væv homogenisator. Der bør ikke være hele stykker fluen tilbage. Næste, fortynd homogenatet med 875 mikroliter mMRS, vortex homogenatet i fem sekunder og pipette 120 mikroliter i den første brønd af en mikrotiterplade.
Fjern 10 mikroliter fra den første brønd og tilsæt den til den anden brønd, der indeholder 70 mikroliter MRS. Bland indholdet af den anden godt grundigt. og bland grundigt. Overfør 10 mikroliter af hver fortynding til en mMRS-plade. Hæld skålen lidt for at sprede fortyndingen flere millimeter ned ad agarens overflade og lad væsken tørre, før du flytter pladen. Fjern pladerne fra inkubatoren, når forskellige individuelle kolonier er synlige, og tæl dem fra en fortynding med 10 til 100 isolerede kolonier. Endelig beregnes CFU per flue.
