Colony Forming Units (CFUs) tellen: bacteriën uit vlieglichamen kwantificeren

- Verzamel eerst vliegen in het gewenste stadium van ontwikkeling en plaats ze in een steriele buis. Om alleen de interne microbiota te tellen, steriliseer de buitenkant van de vliegen door ze onder te dompelen in 70% ethanol. Om zowel de interne als externe microbiota te meten, slaat u deze sterilisatiestap over. Maal vervolgens de vliegen in een klein volume bacteriële groeimedia met behulp van keramische kralen en een weefselhomogenisator, of handmatig met een stamper.

U moet nu een homogeen mengsel hebben dat bacteriën bevat die u kunt kweken. Breng het volume van het homogenaat naar boven met behulp van vloeibaar bacterieel medium. Voer seriële verdunningen van het homogenaat uit en plaats een constant volume van deze verdunningen op het juiste vaste groeimedium voor uw bacteriën. Naarmate de bacteriën groeien, vormen zich kolonies op de plaat. Zoek de verdunning met een bereik van 10 tot 100 kolonies om de Kolonievormende Eenheden, of KVE, van het monster te bepalen.

In het voorbeeldprotocol zullen we steriele vliegen enten met een gnotobiotische of gedefinieerde bacteriecultuur en CFUs verzamelen en meten.

- Gebruik filtertips om 100 microliters 's nachts over te brengen naar een steriele microfugebuis. Breng vervolgens 200 microliters van elke cultuur over op een plaat met 96 putjes. Verwijder de monsters uit de bioveiligheidskast en centrifugeer ze om de bacteriën te pelleteren. Meet na het maken van een-, twee- en viervoudige verdunningen de optische dichtheid of OD600 op een multi-well plaatleesspectrofotometer.

Verwijder na het verkrijgen van de OD600 het supernatant met een pipettip en gebruik verse mMRS om de pellet opnieuw op te schorten. Meng de verdunde bacteriestammen in gelijke verhoudingen om een cocktail van meerdere soorten te creëren. Breng 50 microliters van de cocktail over naar de conische buizen met het steriele dieet en dechorionated eieren. Zorg ervoor dat u de bacteriën na de eioverdracht toevoegt om besmetting tussen flacons te voorkomen. Plaats vervolgens de ingeënte buizen in een incubator.

Om de Colony Forming Units of CFUs te meten, breng je vijf vliegen over naar een microfugebuis van 1,7 milliliter met 125 microliter keramische kralen en 125 microliters mMRS-bouillon. Homogeniseer de vliegen met behulp van een weefselhomogenisator. Er mogen geen hele stukken van de vlieg overblijven. Verdun vervolgens het homogenaat met 875 microliters mMRS, vortex het homogenaat gedurende vijf seconden en pipet 1.

Verwijder 10 microliters uit de eerste put en voeg deze toe aan de tweede put met 70 microliter MRS. Meng de inhoud van de tweede put grondig. Breng vervolgens 10 microliters over van de tweede put naar de derde put met 70 microliter MRS en meng grondig. Breng 10 microliters van elke verdunning over op een mMRS-plaat. Beweeg de schaal lichtjes om de verdunning enkele millimeters over het oppervlak van de agar te verspreiden en laat de vloeistof drogen. tot 100 geïsoleerde kolonies. Bereken ten slotte de KVE per vlieg.