Encyclopedia of Experiments: Biology
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- सबसे पहले, विकास के वांछित चरण में मक्खियों को इकट्ठा करें और उन्हें बाँझ ट्यूब में रखें। केवल आंतरिक माइक्रोबायोटा की गणना करने के लिए, मक्खियों के बाहरी हिस्से को 70% इथेनॉल में जलमग्न करके बंध्याकरण करें। आंतरिक और बाहरी माइक्रोबायोटा दोनों को मापने के लिए, इस नसबंदी चरण को छोड़ दें। इसके बाद, मिट्टी के विकास की थोड़ी मात्रा में मक्खियों को पीसकर सिरेमिक मोतियों और ऊतक समरूपता का उपयोग करके, या मूसल के साथ मैन्युअल रूप से। नमूनों को दूषित करने से रोकने के लिए बाहरी स्रोतों से बैक्टीरिया पेश न करने की देखभाल की जानी चाहिए।
अब आपके पास एक सजातीय मिश्रण होना चाहिए जिसमें बैक्टीरिया हो सकते हैं जिसे आप संस्कृति कर सकते हैं। तरल बैक्टीरियल माध्यम का उपयोग करके समरूप की मात्रा को लाएं। अपने बैक्टीरिया के लिए उपयुक्त ठोस विकास माध्यम पर इन कमजोरुओं की एक निरंतर मात्रा को कम करने और प्लेट लगाने के लिए सीरियल कमजोर करें। बैक्टीरिया बढ़ने के साथ ही कालोनियों की प्लेट पर बनेगी । कमजोर पड़ने की दूरी है कि 10 से १०० कालोनियों की एक सीमा है कॉलोनी फार्मिंग इकाइयों, या सी, नमूना के नमूने का निर्धारण करने के लिए ।
उदाहरण प्रोटोकॉल में, हम एक gnotobiotic या परिभाषित जीवाणु संस्कृति के साथ बाँझ मक्खियों टीका और इकट्ठा और CFUs उपाय होगा ।
- रात भर ग्रोथ के 100 माइक्रोलीटर को बाँझ माइक्रोफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करने के लिए फिल्टर टिप्स का उपयोग करें। इसके बाद, प्रत्येक संस्कृति के 200 माइक्रोलीटर को 96-वेल प्लेट में स्थानांतरित करें। बायोसेफ्टी कैबिनेट से नमूनों को हटा दें और उन्हें बैक्टीरिया को पेलेट करने के लिए अपकेंद्री करें। एक-, दो-और चार गुना कमजोर करने के बाद, ऑप्टिकल घनत्व या OD600 को एक मल्टी-वेल रीडिंग प्लेटफोटोर पर मापें।
OD600 प्राप्त करने के बाद, एक पिपेट टिप के साथ सुपरनेट निकालें और पैलेट का उपयोग करें और पैलेटर को फिर से निलंबित करने के लिए ताजा एमएमआरएस का उपयोग करें। एक बहु-प्रजाति कॉकटेल बनाने के लिए समान अनुपात में पतला बैक्टीरियल उपभेदों को मिलाएं। 50 माइक्रोलीटर कॉकटेल को बाँझ आहार और डिकेरियोनेटेड अंडे युक्त शंकु नलियों में स्थानांतरित करें। शीशियों के बीच संदूषण को रोकने के लिए अंडे के हस्तांतरण के बाद बैक्टीरिया को जोड़ना सुनिश्चित करें।
कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों या सीएफयू को मापने के लिए, पांच मक्खियों को 1.7 मिलीलीटर माइक्रोफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें सिरेमिक मोतियों के 125 माइक्रोलीटर और एमएमआरएस शोरबा के 125 माइक्रोलीटर शामिल हैं। ऊतक समरूपता का उपयोग करके मक्खियों को समरूप बनाना. फ्लाई शेष होने के पूरे टुकड़े नहीं होने चाहिए। इसके बाद, एमएमआरएस के 875 माइक्रोलीटर के साथ समरूप को पतला करें, पांच सेकंड के लिए समरूप भंवर करें, और माइक्रोटिटर प्लेट के पहले कुएं में पिपेट 120 माइक्रोलीटर।
पहले कुएं से 10 माइक्रोलीटर निकालें और इसे दूसरे कुएं में जोड़ें जिसमें एमआरएस के 70 माइक्रोलीटर होते हैं। दूसरे कुएं की सामग्री को अच्छी तरह से मिलाएं। इसके बाद 10 माइक्रोलीटर को दूसरे कुएं से तीसरे कुएं में स्थानांतरित करें जिसमें एमआरएस के 70 माइक्रोलीटर होते हैं, और अच्छी तरह से मिलाएं। प्रत्येक कमजोर पड़ने के 10 माइक्रोलीटर को एक एमएमआरएस प्लेट में स्थानांतरित करें। आगर की सतह के नीचे कई मिलीमीटर कमजोर पड़ने के लिए पकवान को थोड़ा झुकाएं और प्लेट को स्थानांतरित करने से पहले तरल को सूखने दें। एक बार अलग अलग-अलग उपनिवेश दिखाई देने के बाद इनक्यूबेटर से प्लेटों को हटा दें और उन्हें 10 के साथ कमजोर पड़ने से गिनें 100 अलग-थलग कॉलोनियों के लिए। अंत में, प्रति फ्लाई सीएलयू की गणना करें।
