Encyclopedia of Experiments: Biology
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- In primo luogo, raccogliere le mosche nella fase di sviluppo desiderata e posizionarle in un tubo sterile. Per contare solo il microbiota interno, sterilizzare l'esterno delle mosche immergendole nel 70% di etanolo. Per misurare sia il microbiota interno che quello esterno, saltare questa fase di sterilizzazione. Successivamente, macinare le mosche in un piccolo volume di mezzi di crescita batterica utilizzando perline ceramiche e un omogeneizzatore tissutale, o manualmente con un pestello. Occorre fare attenzione a non introdurre batteri da fonti esterne, per evitare di contaminare i campioni.
Ora dovrete avere una miscela omogenea contenente batteri che potete coltivare. Portate il volume dell'omogeneato utilizzando un mezzo batterico liquido. Eseguire diluizioni seriali dell'omogeneato e placcare un volume costante di queste diluizioni sul mezzo di crescita solido appropriato per i batteri. Man mano che i batteri crescono, le colonie si formeranno sulla piastra. Individuare la diluizione che ha un intervallo da 10 a 100 colonie per determinare le unità di formazione della colonia, o CFU, del campione.
Nel protocollo di esempio, inoculeremo mosche sterili con una coltura batterica gnotobiotica o definita e raccoglieremo e misureremo i CFC.
- Utilizzare le punte del filtro per trasferire 100 microlitri di crescita notturna in un tubo di microfugo sterile. Successivamente, trasferire 200 microlitri di ogni coltura su una piastra da 96 po. Rimuovere i campioni dall'armadio di biosicurezza e centrifugarli per pellettizzazione dei batteri. Dopo aver eseguito diluizioni una, due e quattro volte, misurare la densità ottica o OD600 su uno spettrofotometro di lettura a piastre multi-pozzo.
Dopo aver ottenuto l'OD600, rimuovere il supernatante con una punta di pipetta e utilizzare mMRS fresco per sospendere di nuovo il pellet. Mescolare i ceppi batterici diluiti in proporzioni uguali per creare un cocktail multispecie. Trasferire 50 microlitri del cocktail nei tubi conici contenenti la dieta sterile e le uova dechorionated. Assicurarsi di aggiungere i batteri dopo il trasferimento delle uova per prevenire la contaminazione tra flaconcini. Quindi posizionare i tubi inoculati in un'incubatrice.
Per misurare le unità di formazione della colonia o CFU, trasferire cinque mosche in un tubo di microfugo da 1,7 millilitri contenente 125 microlitri di perline ceramiche e 125 microlitri di brodo mMRS. Omogeneizzare le mosche utilizzando un omogeneizzatore di tessuto. Non devono rimanere pezzi interi. Successivamente, diluire l'omogeneato con 875 microlitri di mMRS, vortice dell'omogeneato per cinque secondi e pipetta 120 microlitri nel primo pozzo di una piastra di microtitolato.
Rimuovere 10 microlitri dal primo pozzo e aggiungerlo al secondo pozzo contenente 70 microlitri di MRS. Mescolare accuratamente il contenuto del secondo. Quindi trasferire 10 microlitri dal secondo pozzo al terzo pozzo contenente 70 microlitri di MRS e mescolare accuratamente. Trasferire 10 microlitri di ogni diluizione su una piastra mMRS. Inclinare leggermente il piatto per stendere la diluizione di diversi millimetri lungo la superficie dell'agar e lasciare asciugare il liquido prima di spostare la piastra. Rimuovere le piastre dall'incubatrice una volta visibili singole colonie distinte e contarle da una diluizione con 10 a 100 colonie isolate. Infine, calcolare la CFU per mosca.
