Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- Во-первых, собрать мух на нужной стадии развития и поместить их в стерильную трубку. Чтобы подсчитать только внутреннюю микробиоту, стерилизовать внешний вид мух, погрузив их в 70% этанола. Для измерения как внутренней, так и внешней микробиоты, пропустите этот этап стерилизации. Далее, измельчить мух в небольшом объеме бактериальных средств роста с использованием керамических бусин и гомогенизатора тканей, или вручную с пестиком.
Теперь вы должны иметь однородную смесь, содержащую бактерии, которые вы можете культуры. Принесите вверх объем гомогената с использованием жидкой бактериальной среды. Выполните серийные разбавления гомогената и пластины постоянный объем этих разбавлений на соответствующие твердые среды роста для ваших бактерий. Как бактерии растут, колонии будут образовываться на пластине. Найти разбавления, который имеет диапазон от 10 до 100 колоний, чтобы определить колонии.
В примере протокола мы будем прививать стерильных мух гнотобиотической или определенной бактериальной культурой и собирать и измерять CFUs.
- Используйте фильтр советы для передачи 100 микролитров ночного роста в стерильной трубки микрофуга. Далее, передать 200 микролитров каждой культуры на 96-колодец пластины. Удалить образцы из шкафа биобезопасности и центрифуги их гранулировать бактерии. После принятия одно-, двух-, и четыре раза разбавления, измерить оптическую плотность или OD600 на многоколодец пластины чтения spectrophotometer.
После получения OD600, удалить супернатант с наконечником пипетки и использовать свежие mMRS повторно приостановить гранулы. Смешайте разбавленных бактериальных штаммов в равных соотношениях для создания много видов коктейль. Передача 50 микролитров коктейля в конические трубки, содержащие стерильную диету и dechorionated яйца.
Для измерения единиц формирования колонии или CFUs, перенесите пять мух в 1,7 миллилитровую микротоку, содержащую 125 микролитров керамических бусин и 125 микролитров бульона mMRS. Гомогенизировать мух с помощью тканевого гомогенизатора. Не должно быть целых кусочков мухи, оставшихся. Далее разбавить гомогенат 875 микролитров мРС, вихрь гомогената в течение пяти секунд, и пипетку 120 микролитров в первую колодец микротитрной пластины.
Удалить 10 микролитров из первой хорошо и добавить его во второй колодец, содержащий 70 микролитров MRS. Смешайте содержимое второй хорошо тщательно. Затем перенесите 10 микролитров со второй колодец на третий колодец, содержащий 70 микролитров MRS, и тщательно перемешайте. Перенесите 10 микролитров каждого разбавления в пластину mMRS. Слегка наклоняйте блюдо, чтобы распределить разбавление на несколько миллиметров вниз по поверхности агара и дайте жидкости высохнуть перед перемещением пластины. до 100 изолированных колоний.
