Behandling af insektben til fluorescensmikroskopi: En metode til at bevare neuromuskulære strukturer til billeddannelse

- Til at begynde med nedsænke bedøvede insekter i 70% ethanolopløsning for at reducere neglebåndets hydrofobitet. Vask og gennemtræng væv med fosfatbufferet saltvand, der indeholder et vaskemiddel i mindst 30 minutter for at tillade vævsindtrængning under fiksering.

Fjern derefter hovedet og maven fra brystkassen. Brug pincet til at påføre blidt tryk på coxa-thorax krydset, og tag benet af. Placer forsigtigt benene i iskold 4% paraformaldehydopløsning natten over for at gøre det muligt at trænge ind i vævet. Paraformaldehyd løser væv ved at krydskoble proteiner.

Fjern derefter fikseringsopløsningen og vask vævet flere gange med fosfatbufferet saltvand, der indeholder vaskemiddel. Før montering skal benene placeres i ren eller let fortyndet monteringsbuffer i mindst en dag for at give bufferen tilstrækkelig tid til at komme ind i vævet.

Til sidst monteres benene i en dråbe monteringsmedium. Brug en afstandsstykke mellem mikroskopdiaset og coverlip'en for at forhindre prøven i at beskadige, og fastgør holderen med neglelak.

I følgende eksempel vil vi se dissektion, fiksering og montering af Drosophila melanogasterben.

- Begynd med at fylde det passende antal brønde i en glas multiwell plade med 70% ethanol. Brug en børste til at tilføje 15 til 20 kuldioxid bedøvede fluer af enhver alder eller køn til hver brønd, og forsigtigt duppe fluerne ind i ethanol, indtil de er helt nedsænket.

Efter højst et minut Skyl fluerne tre gange med 0,3% nonionisk overfladeaktivt vaskemiddelopløsning i fosfat-bufferet saltvand i mindst 10 minutter pr. vask. Efter den sidste vask skal du bruge pincet til at fjerne hoved og underliv for hver flue uden at beskadige brystsegmentet eller benene og bruge spidsen af et par fine pincet til forsigtigt, men fast at lægge pres på coxa-thorax-krydset for at løsne det ene ben fra brystsegmentet.

Placer benene i en brønd af en ny multiwell plade, der indeholder frisklavet 4% paraformaldehyd på is, for en overnatning inkubation ved 4 grader Celsius.

- Det er vigtigt at skubbe benene forsigtigt ind i fikseringsbufferen uden at lade dem flyde for at opnå velfaste ben.

- Den næste dag vaskes benene fem gange i frisk 0,3% nonionisk overfladeaktiv vaskemiddelopløsning i 20 minutter pr. vask. Efter den sidste vask skal vaskemidlet udskiftes med monteringsmedium og holde benene i monteringsmediet i mindst 24 timer.

Den næste dag, tilføje ca 20 mikroliter af 70% glycerol ved siden af den belagte ende af glasset mikroskop dias og dække glycerol med en 22 af 22 millimeter coverslip. Næste, tilføje i omkring 10-microliter linje montering medium til højre for coverslip og anvende en anden 30-microliter linje montering medium til højre for 10-microliter linje.

Ved hjælp af fine pincet, overføre det ene ben fra multiwell plade i en dråbe medium til 10-mikroliter strimmel af montering medium i en ekstern side op eller ned orientering. Gentag indtil seks til otte ben er blevet monteret og justeret, og placere en anden coverslip over benene, således at den anden coverslip hviler lidt på den første coverlip. Derefter bruge neglelak i hvert hjørne af coverslips at sikre dem på plads.