Verwerking van insectenpoten voor fluorescentiemicroscopie: een methode om neuromusculaire structuren voor beeldvorming te behouden

- Dompel om te beginnen verdoofde insecten onder in 70% ethanoloplossing om de hydrofobiciteit van de nagelriem te verminderen. Was en permeabiliseer vervolgens het weefsel met fosfaatgebufferde zoutoplossing met een reinigingsmiddel gedurende ten minste 30 minuten om weefselpenetratie tijdens fixatie mogelijk te maken.

Verwijder vervolgens het hoofd en de buik van de thorax. Gebruik een tang om zachte druk uit te oefenen op de coxa-thoraxverbinding en maak het been los. Plaats de benen 's nachts voorzichtig in ijskoude 4% paraformaldehyde-oplossing om het weefsel te laten binnendringen. Paraformaldehyde fixeert weefsels door eiwitten met elkaar te verbinden.

Verwijder vervolgens de fixatieoplossing en was het weefsel meerdere keren met fosfaatgebufferde zoutoplossing met reinigingsmiddel. Plaats de poten vóór de montage ten minste één dag in een zuivere of licht verdunde montagebuffer om voldoende tijd te bieden voor de buffer om het weefsel binnen te komen.

Monteer ten slotte de poten in een druppel montagemedium. Gebruik een afstandhouder tussen de microscoopschuif en de afdeklip om beschadiging van het monster te voorkomen en bevestig de houder met nagellak.

In het volgende voorbeeld zien we de dissectie, fixatie en montage van Drosophila melanogasterbenen.

- Begin met het vullen van het juiste aantal putten in een glazen multiwell plaat met 70% ethanol. Gebruik een borstel om 15 tot 20 koolzuurhoudende vliegen van elke leeftijd of geslacht aan elke put toe te voegen en dep de vliegen voorzichtig in de ethanol totdat ze volledig ondergedompeld zijn.

Spoel de vliegen na niet meer dan één minuut drie keer af met 0,3% niet-ionische oppervlakteactieve wasmiddeloplossing in fosfaatgebufferde zoutoplossing gedurende ten minste 10 minuten per wasbeurt. Gebruik na de laatste wasbeurt een tang om het hoofd en de buik van elke vlieg te verwijderen zonder het thoracale segment of de benen te beschadigen, en gebruik de punt van een paar fijne tangen om voorzichtig maar stevig druk uit te oefenen op de coxa-thoraxverbinding om één been los te maken van het thoracale segment.

Plaats de poten in één put van een nieuwe multiwellplaat, die vers bereide 4% paraformaldehyde op ijs bevat, voor een nachtelijke incubatie bij 4 graden Celsius.

- Het is belangrijk om de benen voorzichtig in de fixatiebuffer te duwen zonder ze te laten zweven om goed gefixeerde poten te verkrijgen.

- Was de volgende dag de poten vijf keer in verse 0,3% nonionische oppervlakteactieve wasmiddeloplossing gedurende 20 minuten per wasbeurt. Vervang na de laatste wasbeurt het wasmiddel door het montagemedium en houd de poten minstens 24 uur in het montagemedium.

Voeg de volgende dag ongeveer 20 microliters van 70% glycerol toe naast het gecoate uiteinde van de glasmicroscoopschuif en bedek de glycerol met een afdeklip van 22 bij 22 millimeter. Voeg vervolgens ongeveer 10-microliter lijn van montagemedium toe aan de rechterkant van de afdeklip en breng een tweede 30-microliter lijn van montagemedium aan rechts van de 10-microliter lijn.

Breng met behulp van een fijne tang één been van de multiwell-plaat in een druppel medium over naar de 10-microliter strip van het montagemedium in een externe naar boven of naar beneden gerichte oriëntatie. Herhaal dit totdat zes tot acht poten zijn gemonteerd en uitgelijnd, en plaats een tweede coverslip over de benen, zodat de tweede coverlip iets op de eerste coverslip rust. Gebruik vervolgens nagellak in elke hoek van de coverslips om ze op hun plaats te bevestigen.