Traitement des pattes d’insectes pour la microscopie par fluorescence : une méthode pour préserver les structures neuromusculaires pour l’imagerie

- Pour commencer, submergez les insectes anesthésiés dans une solution d’éthanol à 70 % pour réduire l’hydrophobicité de la cuticule. Puis, lavez et perméabilisez le tissu avec une solution saline tamponnée de phosphate contenant un détergent pendant au moins 30 minutes pour permettre la pénétration des tissus pendant la fixation.

Ensuite, retirez la tête et l’abdomen du thorax. Utilisez des forceps pour appliquer une pression douce sur la jonction coxa-thorax, et détachez la jambe. Placez soigneusement les jambes dans une solution de paraformaldéhyde glacée à 4 % pendant la nuit pour lui permettre de pénétrer dans le tissu. Le paraformaldéhyde fixe les tissus par des protéines qui relient.

Ensuite, retirez la solution de fixation et lavez le tissu plusieurs fois avec de la solution saline tamponnée de phosphate contenant du détergent. Avant de monter, placez les jambes dans un tampon de montage pur ou légèrement dilué pendant au moins une journée pour donner suffisamment de temps au tampon pour entrer dans le tissu.

Enfin, montez les jambes dans une goutte de milieu de montage. Utilisez un espaceur entre la lame de microscope et le coverslip pour empêcher le spécimen d’endommager, et fixez la monture avec du vernis à ongles.

Dans l’exemple suivant, nous verrons la dissection, la fixation et le montage des jambes de Drosophila melanogaster.

- Commencez par remplir le nombre approprié de puits dans une plaque multiwell en verre avec 70% d’éthanol. Utilisez une brosse pour ajouter 15 à 20 mouches anesthésiées au dioxyde de carbone de tout âge ou sexe à chaque puits, et tamponnez doucement les mouches dans l’éthanol jusqu’à ce qu’elles soient complètement submergées.

Après pas plus d' une minute, rincer les mouches trois fois avec une solution de détergent surfactant non ionique de 0,3 % dans la solution saline tamponnée de phosphate pendant au moins 10 minutes par lavage. Après le dernier lavage, utilisez des forceps pour enlever la tête et l’abdomen de chaque mouche sans endommager le segment thoracique ou les jambes, et utilisez la pointe d’une paire de forceps fins pour appliquer doucement mais fermement la pression sur la jonction barre-thorax pour détacher une jambe du segment thoracique.

Placez les pattes dans un puits d’une nouvelle plaque multiwell, contenant du paraformaldéhyde fraîchement préparé à 4 % sur la glace, pour une incubation d’une nuit à 4 degrés Celsius.

- Il est important de pousser doucement les jambes dans le tampon de fixation sans les laisser flotter pour obtenir des jambes bien fixées.

- Le lendemain, lavez les jambes cinq fois dans une solution de détergent surfactant non ionique frais de 0,3 % pendant 20 minutes par lavage. Après le dernier lavage, remplacez le détergent par un milieu de montage et gardez les jambes dans le milieu de montage pendant au moins 24 heures.

Le lendemain, ajouter environ 20 microlitres de 70 % de glycérol à côté de l’extrémité enduite de la lame de microscope en verre et couvrir le glycérol d’un couvercle de 22 x 22 millimètres. Ensuite, ajoutez une ligne d’environ 10 microlitres de milieu de montage à droite du coverslip et appliquez une deuxième ligne de 30 microlitres de milieu de montage à droite de la ligne de montage de 10 microlitres.

À l’aide de forceps fins, transférer une jambe de la plaque multiwell dans une goutte de milieu à la bande de montage de 10 microlitres dans un côté externe vers le haut ou vers le bas orientation. Répétez jusqu’à ce que six à huit jambes ont été montés et alignés, et placez un deuxième coverslip sur les jambes de sorte que le deuxième coverslip repose légèrement sur le premier coverslip. Puis, utilisez du vernis à ongles à chaque coin des coverslips pour les fixer en place.