Verarbeitung von Insektenbeinen für die Fluoreszenzmikroskopie: Eine Methode zur Erhaltung neuromuskulärer Strukturen für die Bildgebung

- Um zu beginnen, tauchen Sie anästhesierte Insekten in 70% Ethanollösung, um die Hydrophobie der Nagelhaut zu reduzieren. Dann waschen und durchlässigen Sie das Gewebe mit phosphatgepufferter Salzin, die ein Reinigungsmittel enthält, für mindestens 30 Minuten, um die Gewebepenetration während der Fixierung zu ermöglichen.

Als nächstes entfernen Sie den Kopf und den Bauch aus dem Thorax. Verwenden Sie Zangen, um sanften Druck auf die Coxa-Thorax-Kreuzung auszuüben, und lösen Sie das Bein. Legen Sie die Beine vorsichtig in eiskalte 4% Paraformaldehydlösung über Nacht, damit sie in das Gewebe eindringen können. Paraformaldehyd fixiert Gewebe durch Vernetzung von Proteinen.

Entfernen Sie dann die Fixierlösung und waschen Sie das Gewebe mehrmals mit phosphatgepufferter, mit Waschmittel gepufferter Waschmittel. Legen Sie die Beine vor der Montage mindestens einen Tag lang in einen reinen oder leicht verdünnten Montagepuffer, um genügend Zeit für den Puffer in das Gewebe zu schaffen.

Schließlich montieren Sie die Beine in einem Tropfen des Montagemediums. Verwenden Sie einen Abstandshalter zwischen dem Mikroskopschlitten und dem Deckelrutsch, um schäden zu verhindern, und sichern Sie die Halterung mit Nagellack.

Im folgenden Beispiel sehen wir die Sezieren, Fixierung und Montage von Drosophila melanogaster Beinen.

- Beginnen Sie mit dem Füllen der entsprechenden Anzahl von Brunnen in einer Glas-Multiwell-Platte mit 70% Ethanol. Verwenden Sie eine Bürste, um 15 bis 20 Kohlendioxid anästhesierte Fliegen jeden Alters oder Geschlechts zu jedem Brunnen hinzuzufügen, und die Fliegen vorsichtig in das Ethanol zu tappen, bis sie vollständig untergetaucht sind.

Nach nicht mehr als einer Minute die Fliegen dreimal mit 0,3% nichtionischer Tensid-Waschmittellösung in phosphatgepufferter Saline für mindestens 10 Minuten pro Waschgang abspülen. Nach der letzten Wäsche, verwenden Sie Zange, um den Kopf und Bauch jeder Fliege zu entfernen, ohne das Brustsegment oder die Beine zu beschädigen, und verwenden Sie die Spitze eines Paares von feinen Zangen, um sanft, aber fest Druck auf die Coxa-Thorax-Kreuzung auszuüben, um ein Bein vom Brustsegment zu lösen.

Legen Sie die Beine in einen Brunnen einer neuen Mehrwellplatte, die frisch zubereitetes 4% Paraformaldehyd auf Eis enthält, für eine nächtliche Inkubation bei 4 Grad Celsius.

- Es ist wichtig, die Beine sanft in den Fixierungspuffer zu schieben, ohne sie schweben zu lassen, um gut fixierte Beine zu erhalten.

- Am nächsten Tag die Beine fünfmal in frischer 0,3% nichtionischer Tensid-Reinigungslösung für 20 Minuten pro Wäsche waschen. Nach dem letzten Waschen das Waschmittel durch Montagemedium ersetzen und die Beine mindestens 24 Stunden im Montagemedium halten.

Am nächsten Tag ca. 20 Mikroliter 70% Glycerin neben das beschichtete Ende des Glasmikroskopschlittens geben und das Glycerin mit einem 22 mal 22 Millimeter großen Deckelbelag bedecken. Als nächstes ca. 10-Mikroliter-Linie des Montagemediums rechts vom Deckelschlupf hinzufügen und eine zweite 30-Mikroliter-Linie des Montagemediums rechts von der 10-Mikroliter-Linie auftragen.

Mit feinen Zangen, übertragen Sie ein Bein von der Multiwell-Platte in einem Tropfen des Mediums auf den 10-Mikroliter-Streifen des Montagemediums in einer äußeren Seite nach oben oder unten Ausrichtung. Wiederholen Sie, bis sechs bis acht Beine montiert und ausgerichtet wurden, und legen Sie einen zweiten Deckelslip über die Beine, so dass der zweite Deckelrutsch leicht auf dem ersten Deckelschlupf ruht. Dann verwenden Sie Nagellack an jeder Ecke der Abdeckungen, um sie an Ort und Stelle zu sichern.