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JoVE Encyclopedia of Experiments
Encyclopedia of Experiments: Biology

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फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के लिए कीट पैरों को संसाधित करना

 
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फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के लिए कीट पैरों को संसाधित करना: इमेजिंग के लिए न्यूरोमस्कुलर संरचनाओं को संरक्षित करने की एक विधि

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- शुरू करने के लिए, क्यूटिकल की हाइड्रोफोबसिटी को कम करने के लिए 70% इथेनॉल समाधान में एनेस्थेटाइज्ड कीड़े को जलमग्न करें। फिर, निर्धारण के दौरान ऊतक प्रवेश की अनुमति देने के लिए कम से कम 30 मिनट के लिए डिटर्जेंट युक्त फॉस्फेट-बफर वाले खारा के साथ ऊतक को धोएं और पार करें।

इसके बाद, सिर और पेट को छाती से निकाल दें। कोक्सा-छाती के जंक्शन पर कोमल दबाव लागू करने के लिए संदंश का प्रयोग करें, और पैर को अलग करें। ध्यान से पैरों को बर्फ-ठंडे 4% पैराफॉर्मलडिहाइड समाधान में रात भर रखें ताकि यह ऊतकों को भेदने की अनुमति दे सके । पैराफॉर्मलडिहाइड प्रोटीन को क्रॉस-लिंक करके ऊतकों को ठीक करता है ।

फिर, फिक्सेशन समाधान को हटा दें और डिटर्जेंट युक्त फॉस्फेट-बफर नमकीन के साथ कई बार ऊतक को धोएं। बढ़ते से पहले, पैरों को शुद्ध या थोड़ा पतला बढ़ते बफर में कम से कम एक दिन के लिए रखें ताकि बफर को ऊतक में प्रवेश करने के लिए पर्याप्त समय प्रदान किया जा सके।

अंत में, बढ़ते माध्यम की एक बूंद में पैरों को माउंट करें। नमूने को नुकसान से रोकने के लिए माइक्रोस्कोप स्लाइड और कवरस्लिप के बीच एक स्पेसर का उपयोग करें, और नेल पॉलिश के साथ माउंट को सुरक्षित करें।

निम्नलिखित उदाहरण में, हम ड्रोसोफिला मेलनोगेस्टर पैरों के विच्छेदन, निर्धारण और बढ़ते देखेंगे।

- 70% इथेनॉल के साथ एक ग्लास मल्टीवेल प्लेट में उचित संख्या में कुओं को भरकर शुरू करें। प्रत्येक कुएं में किसी भी उम्र या सेक्स की 15 से 20 कार्बन डाइऑक्साइड एनेस्थेटाइज्ड मक्खियों को जोड़ने के लिए ब्रश का उपयोग करें, और मक्खियों को धीरे-धीरे इथेनॉल में डब करें जब तक कि वे पूरी तरह से जलमग्न न हो जाएं।

एक मिनट से अधिक समय के बाद, फास्फेट-बफर खारा में 0.3% नॉनिएनिक सर्फेक्टेंट डिटर्जेंट समाधान के साथ तीन बार मक्खियों को कुल्ला कम से कम 10 मिनट प्रति वॉश के लिए। पिछले धोने के बाद, संक्षार खंड या पैरों को नुकसान पहुंचाए बिना प्रत्येक फ्लाई के सिर और पेट को हटाने के लिए संदंश का उपयोग करें, और ठीक बल की एक जोड़ी की नोक का उपयोग धीरे से लेकिन दृढ़ता से छाती खंड से एक पैर detach करने के लिए ठीक बल की नोक का उपयोग करें

पैरों को एक नई मल्टीवेल प्लेट के एक कुएं में रखें, जिसमें बर्फ पर ताजा तैयार 4% पैराफॉर्मलडिहाइड होता है, जो रात भर इनक्यूबेशन 4 डिग्री सेल्सियस पर होता है।

- पैरों को धीरे-धीरे फिक्सेशन बफर में धकेलना महत्वपूर्ण है, बिना उन्हें अच्छी तरह से तय पैरों को प्राप्त करने के लिए तैरने दें।

- अगले दिन, पैरों को ताजा 0.3% नॉनएनिक सर्फेक्टेंट डिटर्जेंट समाधान में 20 मिनट प्रति वॉश के लिए धोएं। पिछले धोने के बाद, डिटर्जेंट को बढ़ते माध्यम से बदलें और पैरों को बढ़ते माध्यम में कम से कम 24 घंटे तक रखें।

अगले दिन, ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड के लेपित अंत के बगल में 70% ग्लाइस्रोल के लगभग 20 माइक्रोलीटर जोड़ें और ग्लिसरोल को 22 बाय 22 मिलीमीटर कवरलिप के साथ कवर करें। इसके बाद, कवरस्लिप के दाईं ओर बढ़ते माध्यम की लगभग 10 माइक्रोलीटर लाइन जोड़ें और 10 माइक्रोलीटर लाइन के दाईं ओर बढ़ते माध्यम की दूसरी 30-माइक्रोलीटर लाइन लागू करें।

ठीक संदंश का उपयोग करके, एक पैर को एक पैर को मध्यम की एक बूंद में एक बाहरी पक्ष में बढ़ते माध्यम की 10-माइक्रोलीटर पट्टी में स्थानांतरित करें। छह से आठ पैरों को घुड़सवार और गठबंधन किए जाने तक दोहराएं, और पैरों के ऊपर एक दूसरा कवरलिप रखें ताकि दूसरा कवर्स पहले कवर्लिप पर थोड़ा टिका हो।

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