إعداد الخلايا النزفية الثابتة لاحتواء المناعة: طريقة عالية الإنتاجية لإصلاح وإزالة الغشاء الخارجي

- ابدأ بالنبض مخدر Drosophila جنبا إلى جنب مع العازلة في خلاط لتفريق الذباب إلى قطع صغيرة. تصفية الخليط من خلال شبكة لإزالة أجزاء الجسم الكبيرة.

كرر هذه العملية باستخدام شبكة أصغر لإزالة الحطام الإضافي. اجمع البيض في قارورة، وإذا كان للبيض أن يعالج بدواء، فافعل ذلك عند هذه النقطة.

ثم، يغسل المثبت مع PBS. لتلطيخ البويضات، وإزالة الأغشية الخارجية الواقية للسماح لاختراق الأجسام المضادة.

في بروتوكول المثال ، سنقوم بإعداد البويضات في meiosis I لتلطيخ وتصور جهاز المغزل.

- للبدء، قم بقطع الجزء الداخلي من أنبوب سعة 5 ملليلتر وماصة باستور مع PTB لمنع البويضات العالقة على الأسطح.

قم بتصفية الطين الناتج إلى كوب 250 ملليلتر من خلال شبكة كبيرة مع مسام تبلغ حوالي 1500 ميكرومتر.

شطف الكأس الأول باستخدام عازلة إضافية في ماصة المغلفة لجمع البويضات المتبقية.

إضافة ما تبقى من 10 ملليلتر من الطين والسماح للمزيج يستقر مرة أخرى قبل إزالة السائل. شطف أي البويضات المتبقية من الكأس باستخدام عازلة إضافية في ماصة المغلفة.

لإصلاح المبيضين، أولا، يستنشق جميع السوائل من الأنسجة، وعلى الفور إضافة 1 ملليلتر من مزيج الإصلاح. ضع الأنسجة على نوتاتور لمدة دقيقتين ونصف.

إزالة جميع السوائل من الأنسجة المستقرة، ثم إضافة 1 ملليلتر من 1x PBS. دوامة الأنبوب لمدة 30 ثانية، ومن ثم السماح للبويضات لتسوية لمدة دقيقة واحدة.

باستخدام ماصة المغلفة، إضافة ما يقرب من 500 إلى 1000 البويضات إلى شريحة زجاجية متجمدة. إزالة أي أجزاء الجسم الدخيلة أو المواد باستخدام ملقط. ضع غطاء على رأس الأنسجة، ولفة بلطف البويضات حتى تتم إزالة جميع الأغشية. سحب حافة الغطاء عبر البويضات يعمل بشكل جيد. تحقق من تقدم إزالة الغشاء تحت المجهر بشكل دوري.