为免疫维护准备固定 的果蝇 卵母细胞：修复和去除外膜的高通量方法

- 首先在搅拌机中脉动麻醉的果蝇和缓冲器，将苍蝇分解成小块。通过网格过滤混合物，去除大身体部位。然后，让鸡蛋下沉，而较大的碎片留在表面，可以去除。

使用较小的网格重复此过程以清除其他碎屑。 将鸡蛋收集在小瓶中，如果鸡蛋要用药物治疗，请此时进行处理。 接下来，取出液体，用固定物代替。加入己烷，帮助固定物穿透鸡蛋周围的膜。

然后，用PBS洗去固定物。 要染色卵母细胞，请取出保护性外膜，以便抗体穿透。将卵母细胞移到玻璃滑梯的磨砂部分。 将盖片放在鸡蛋上，然后以来回运动轻轻滚动盖片，以机械地将卵子和紫水晶膜从鸡蛋中分离出来。 卵母细胞现在已准备好染色。

在示例协议中，我们将准备肌瘤I 中的卵母细胞，以染色和可视化主轴设备。

- 首先，用PTB预切5毫升管和巴斯德移液器的内部，以防止卵母细胞粘在表面。在搅拌机中加入100毫升Rob的缓冲器，然后加入100至300只麻醉苍蝇，在一秒钟内三次脉冲。

通过毛孔约 1500 微米的大网格将由此产生的泥浆过滤成 250毫米烧嘴。让过滤片沉淀约两分钟，然后吸气顶层，去除尽可能多的大身体部位。 通过孔径为300微米的较小网格再次将泥浆过滤成250 毫升烧嘴。

在涂层移液器中使用额外的缓冲器冲洗第一个烧杯，以收集剩余的卵母细胞。 让泥浆沉淀三分钟，然后吸气除底部10毫升外的所有物。 将尽可能多的 10 毫升倒入涂层的5 毫升管中。让泥浆沉淀约两分钟，然后小心地去除液体。

加入剩余的10毫升泥浆，让混合物在去除液体之前再次稳定下来。 使用涂层移液器中的额外缓冲器冲洗烧杯中剩余的卵母细胞。让冲洗剂在5 毫升管中沉淀三到五分钟。

要修复卵巢，首先，吸气从组织的所有液体，并立即添加1毫升的固定组合。 将组织放在坚果上两分半钟。接下来，加入1毫升的六氯烷，使管子旋转一分钟，然后让卵母细胞再沉淀一分钟。

从固定的组织中取出所有液体，然后加入1毫升1倍PBS。将管子漩涡30秒，然后让卵母细胞沉淀一分钟。之后，从管中取出所有液体，用5毫升1XPBS填充。

使用涂层移液器，在磨砂玻璃滑梯上加入大约 500 到 1，000 个卵母细胞。使用钳子去除任何无关的身体部位或材料。 在组织顶部放置盖片，轻轻滚动卵母细胞，直到取出所有膜。 将盖片边缘拖过卵母细胞效果良好。 定期检查显微镜下膜去除的进度。压力太大会破坏卵母细胞。