Préparation d’ovocytes fixes de drosophile pour l’immunostaining : méthode à haut débit pour fixer et enlever la membrane externe

- Commencez par pulser la drosophile anesthésiée avec le tampon dans un mélangeur pour briser les mouches en petits morceaux. Filtrer le mélange à travers un maillage pour enlever les grandes parties du corps. Ensuite, laissez couler les œufs pendant que les plus gros fragments restent à la surface et peuvent être enlevés.

Répétez ce processus à l’aide d’un maillage plus petit pour enlever les débris supplémentaires. Recueillir les œufs dans un flacon, et si les œufs doivent être traités avec un médicament, le faire à ce stade. Ensuite, retirez le liquide et remplacez-le par fixatif. Ajouter de l’heptane pour aider le fixatif à pénétrer la membrane entourant l’œuf.

Ensuite, lavez le fixatif avec PBS. Pour tacher les ovocytes, retirez les membranes extérieures protectrices pour permettre la pénétration des anticorps. Pipette les ovocytes sur la partie givrée d’une glissade de verre. Placez un coverslip sur les oeufs et roulez doucement le coverslip dans un mouvement de va-et-vient pour séparer mécaniquement la chorion et la membrane vitelline de l’œuf. Les ovocytes sont maintenant prêts à être tachés.

Dans le protocole d’exemple, nous préparerons des ovocytes dans la méiose I pour tacher et visualiser l’appareil de fuseau.

- Pour commencer, précouper l’intérieur d’un tube de 5 millilitres et d’une pipette Pasteur avec PTB pour éviter que les ovocytes ne collent aux surfaces. Ajouter 100 millilitres de tampon de Rob à un mélangeur, puis ajouter 100 à 300 mouches anesthésiées et pulser trois fois pendant une seconde.

Filtrer le lisier qui en résulte dans un bécher de 250 millilitres à travers un grand maillage avec des pores d’environ 1500 micromètres. Laissez le filtrate se contenter d’environ deux minutes, puis aspirez la couche supérieure, en enlevant autant de grandes parties du corps que possible. Filtrer le lisier à nouveau dans un bécher de 250 millilitres à travers une maille plus petite avec la taille du pore de 300 micromètres.

Rincer le premier bécher à l’aide d’un tampon supplémentaire dans la pipette enduite pour recueillir les ovocytes restants. Laisser le lisier se déposer pendant trois minutes, puis aspirer tous sauf les 10 millilitres du fond. Verser autant de 10 millilitres que possible dans le tube enduit de 5 millilitres. Laissez le lisier se déposer pendant environ deux minutes, puis retirez soigneusement le liquide.

Ajouter le reste des 10 millilitres de boue et laisser le mélange se déposer à nouveau avant d’enlever le liquide. Rincer les ovocytes restants du bécher à l’aide d’un tampon supplémentaire dans la pipette enduite. Laisser le rinçage se déposer dans le tube de 5 millilitres pendant trois à cinq minutes.

Pour fixer les ovaires, d’abord, aspirer tout le liquide des tissus, et ajouter immédiatement 1 millilitre de mélange fixe. Placez les tissus sur un nutator pendant deux minutes et demie. Ensuite, ajoutez 1 millilitre d’heptane, vortex le tube pendant une minute, puis laissez les ovocytes se contenter d’une minute supplémentaire.

Retirer tout le liquide du tissu réglé, puis ajouter 1 millilitre de 1x PBS. Vortex le tube pendant 30 secondes, puis laisser les ovocytes de se contenter d’une minute. Après cela, retirer tout le liquide du tube et le remplir de cinq millilitres de 1x PBS.

À l’aide de la pipette enduite, ajouter environ 500 à 1 000 ovocytes à une glissière en verre givré. Enlever les parties du corps ou le matériau étrangers à l’aide de forceps. Placer un coverslip sur le dessus du tissu et rouler doucement les ovocytes jusqu’à ce que toutes les membranes soient enlevées.