Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- छोटे टुकड़ों में मक्खियों को तोड़ने के लिए एक ब्लेंडर में बफर के साथ एनेस्थेटाइज्ड ड्रोसोफिला स्पंदन करके शुरू करें। शरीर के बड़े अंगों को हटाने के लिए एक जाल के माध्यम से मिश्रण को फ़िल्टर करें। फिर, अंडे को डूबने दें जबकि बड़े टुकड़े सतह पर रहते हैं और हटाया जा सकता है।
अतिरिक्त मलबे को हटाने के लिए एक छोटे जाल का उपयोग करके इस प्रक्रिया को दोहराएं। अंडे को एक शीशी में इकट्ठा करें, और यदि अंडे का इलाज दवा के साथ किया जाना है, तो इस बिंदु पर करें। इसके बाद, तरल को हटा दें और इसे सुधार के साथ प्रतिस्थापित करें। फिक्सेटिव को अंडे के आसपास की झिल्ली में प्रवेश करने में मदद करने के लिए हेप्टेन जोड़ें।
फिर, पीबीएस के साथ फिक्सेटिव को धो लें। oocytes को दाग लगाने के लिए, एंटीबॉडी प्रवेश के लिए अनुमति देने के लिए सुरक्षात्मक बाहरी झिल्ली को हटा दें। एक ग्लास स्लाइड के पाले से ओढ़ने वाले हिस्से पर ओसाइट्स रखें। अंडे के ऊपर एक कवरलिप रखें और धीरे-धीरे अंडे से कोरियोन और विटेललाइन झिल्ली को अलग करने के लिए पीछे की गति में कवर्लिप को रोल करें।
उदाहरण प्रोटोकॉल में, हम धुरी तंत्र को दाग और कल्पना करने के लिए मेयोसिस I में ओसाइट्स तैयार करेंगे।
- शुरू करने के लिए, सतहों से चिपके ओसाइट्स को रोकने के लिए पीटीबी के साथ 5 मिलीलीटर ट्यूब और पाश्चुर पिपेट के अंदर प्रीकट करें। 100 मिलीलीटर रोब के बफर को ब्लेंडर में जोड़ें और फिर एक सेकंड के लिए तीन बार 100 से 300 एनेस्थेटाइज्ड मक्खियों और पल्स जोड़ें।
परिणामी घोल को लगभग 1500 माइक्रोमीटर के छिद्रों के साथ एक बड़े जाल के माध्यम से 250 मिलीलीटर बीकर में फ़िल्टर करें। फिलट्रेट को लगभग दो मिनट तक व्यवस्थित होने दें और फिर शीर्ष परत को उत्तेजित करें, शरीर के कई बड़े अंगों को हटा दें। 300 मीटर के पोर आकार के साथ एक छोटे जाल के माध्यम से घोल को फिर से 250 मिलीलीटर बीकर में फ़िल्टर करें।
शेष ओसाइट को इकट्ठा करने के लिए लेपित पिपेट में अतिरिक्त बफर का उपयोग करके पहले बीकर को कुल्ला करें। घोल को तीन मिनट के लिए व्यवस्थित होने दें और फिर नीचे के 10 मिलीलीटर को उत्तेजित करें। 10 मिलीलीटर में से अधिक को लेपित 5 मिलीलीटर ट्यूब में डालें। घोल को लगभग दो मिनट तक व्यवस्थित होने दें और फिर सावधानी से तरल को हटा दें।
शेष 10 मिलीलीटर घोल डालें और तरल को हटाने से पहले मिश्रण को फिर से व्यवस्थित होने दें। लेपित पिपेट में अतिरिक्त बफर का उपयोग करके बीकर से किसी भी शेष ओसाइट्स को कुल्ला करें। कुल्ला को तीन से पांच मिनट के लिए 5 मिलीलीटर ट्यूब में व्यवस्थित होने दें।
अंडाशय को ठीक करने के लिए, सबसे पहले, ऊतकों से सभी तरल को हटा दें, और तुरंत 1 मिलीलीटर फिक्स मिक्स जोड़ें। ऊतकों को ढाई मिनट के लिए एक न्यूटोटर पर रखें। इसके बाद, हेप्टेन के 1 मिलीलीटर जोड़ें, एक मिनट के लिए ट्यूब भंवर, और फिर ओसाइट्स को एक मिनट के लिए व्यवस्थित करने की अनुमति दें।
बसे हुए टिश्यू से सभी लिक्विड निकालें, फिर 1x पीबीएस के 1 मिलीलीटर डालें। 30 सेकंड के लिए ट्यूब को भंवर दें और फिर ओसाइट्स को एक मिनट के लिए व्यवस्थित होने दें इसके बाद ट्यूब से सभी लिक्विड निकालकर 1x पीबीएस के पांच मिलीलीटर से भर दें।
लेपित पिपेट का उपयोग करना, एक पाले से ओढ़लिया ग्लास स्लाइड में लगभग 500 से 1,000 ओसाइट्स जोड़ें। किसी भी बाहरी शरीर के अंगों या सामग्री को संदंश का उपयोग करके हटा दें। ऊतक के शीर्ष पर एक कवरलिप रखें, और धीरे-धीरे ओसाइट्स को रोल करें जब तक कि सभी झिल्ली हटा न न जाएं। ओसाइट्स के पार कवरलिप के किनारे को खींचना अच्छी तरह से काम करता है। समय-समय पर माइक्रोस्कोप के नीचे झिल्ली को हटाने की प्रगति की जांच करें।
