Encyclopedia of Experiments: Biology
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- Comience pulsando drosophila anestesiada junto con tampón en una licuadora para dividir las moscas en trozos pequeños. Filtra la mezcla a través de una malla para eliminar las partes grandes del cuerpo.
Repita este proceso utilizando una malla más pequeña para eliminar los desechos adicionales. Recoger los huevos en un vial, y si los huevos deben ser tratados con un medicamento, hacerlo en este punto.
Luego, lave el fijador con PBS. Para manchar los ócitos, retire las membranas externas protectoras para permitir la penetración de anticuerpos. Pipetear los ocitos en la parte esmerilada de un tobogán de vidrio. Coloque un cubrecoches sobre los huevos y enrolle suavemente el tubo de cubierta en un movimiento de ida y vuelta para separar mecánicamente la membrana coral y vitellina del huevo.
En el protocolo de ejemplo, estaremos preparando ocitos en meiosis I para manchar y visualizar el aparato del husillo.
- Para empezar, precorte el interior de un tubo de 5 mililitros y una pipeta Pasteur con PTB para evitar que los ocitos se peguen en las superficies.
Filtra el lodo resultante en un vaso de precipitados de 250 mililitros a través de una malla grande con poros de alrededor de 1500 micrómetros. Deja que el filtrado se asiente durante unos dos minutos y luego aspira la capa superior, eliminando tantas partes grandes del cuerpo como sea posible. Filtra el lodo de nuevo en un vaso de precipitados de 250 mililitros a través de una malla más pequeña con el tamaño del poro de 300 micrómetros.
Enjuague el primer vaso utilizando un amortiguador adicional en la pipeta recubierta para recoger los ocitos restantes. Deje que el lodo se asiente durante tres minutos y luego aspire todo menos los 10 mililitros inferiores. Vierta la mayor cantidad posible de 10 mililitros en el tubo recubierto de 5 mililitros.
Agregue el resto de los 10 mililitros de purines y deje que la mezcla se asiente de nuevo antes de retirar el líquido. Enjuague los ocitos restantes del vaso de precipitados usando un amortiguador adicional en la pipeta recubierta.
Para arreglar los ovarios, primero, aspirar todo el líquido de los tejidos, e inmediatamente añadir 1 mililitro de mezcla de fijación. Coloque los tejidos en un nutator durante dos minutos y medio.
Retire todo el líquido del tejido asentado, luego agregue 1 mililitro de 1x PBS. Vórtice el tubo durante 30 segundos, y luego deje que los ócitos se asienten durante un minuto. Después de eso, retire todo el líquido del tubo y llénelo con cinco mililitros de 1x PBS.
Usando la pipeta recubierta, añadir aproximadamente 500 a 1.000 ócitos a un tobogán de vidrio esmerilado. Retire cualquier parte extraneosa del cuerpo o material usando fórceps. Coloque un tubo de cubierta en la parte superior del tejido, y enrolle suavemente los ócitos hasta que se retiren todas las membranas.
