Beredning av fasta Drosophila-oocyter för immunostaining: En metod med hög genomströmning för att fixa och ta bort det yttre membranet

- Börja med att pulsera bedövad Drosophila tillsammans med buffert i en mixer för att bryta upp flugor i små bitar.

Upprepa denna process med ett mindre nät för att ta bort ytterligare skräp. Samla äggen i en flaska, och om äggen ska behandlas med ett läkemedel, gör det vid denna tidpunkt.

Tvätta sedan bort fixeringen med PBS. För att måla äggcellerna, ta bort de skyddande yttre membranen för att möjliggöra antikroppspenetration. Pipettera äggcellerna på den frostade delen av en glasrutschbana. Placera ett täckglas över äggen och rulla försiktigt täcket i en fram och tillbaka rörelse för att mekaniskt separera kolrion- och vitelinmembranet från ägget.

I exempelprotokollet kommer vi att förbereda oocyter i meios I för att färga och visualisera spindelapparaturen.

- För att börja, förskrida insidan av ett 5-milliliterrör och Pasteurpipett med PTB för att förhindra att äggceller fastnar på ytorna.

Filtrera det resulterande slammet i en 250 milliliter bägare genom ett stort nät med porer på cirka 1500 mikrometer. Låt filtratet sätta sig i cirka två minuter och aspirera sedan det övre skiktet, ta bort så många stora kroppsdelar som möjligt. Filtrera slammet igen till en 250-milliliter bägare genom ett mindre nät med porstorleken 300 mikrometer.

Skölj den första bägaren med hjälp av extra buffert i den belagda pipetten för att samla upp de återstående oocyterna. Låt slammet lägga sig i tre minuter och aspirera sedan alla utom de nedre 10 milliliter. Häll så mycket av de 10 milliliter som möjligt i det belagda 5-milliliterröret. Låt slammet lägga sig i cirka två minuter och ta sedan försiktigt bort vätskan.

Tillsätt återstoden av slurryens 10 milliliter och låt blandningen sätta sig igen innan du tar bort vätskan. Skölj eventuella kvarvarande äggceller ur bägaren med hjälp av ytterligare buffert i den belagda pipetten. Låt sköljningen sätta sig i 5-milliliterröret i tre till fem minuter.

För att fixa äggstockarna aspirerar först bort all vätska från vävnaderna och tillsätt omedelbart 1 milliliter fixblandning. Placera vävnaderna på en mutter i två och en halv minut.

Ta bort all vätska från den sedimenterade vävnaden, tillsätt sedan 1 milliliter 1x PBS. Virvelröret i 30 sekunder och låt sedan äggcellerna bosätta sig i en minut.

Använd den belagda pipetten, tillsätt ungefär 500 till 1 000 äggceller till en frostad glasrutschbana. Ta bort eventuella främmande kroppsdelar eller material med tång. Placera ett täckglas ovanpå vävnaden och rulla försiktigt äggcellerna tills alla membran tas bort.