Chorion og Vitelline Membrane Mekanisk Fjernelse: En metode til at forberede Drosophila Oocytes til direkte observation

- Begynd med modne oocytter fra faste æggestokke i en saltvandsopløsning.

For mekanisk at fjerne chorion og vitellinmembranen skal du placere oocytterne mellem de frostede dele af to forbehandlede dias. Flyt det øverste dias i lige frem og tilbage bevægelser for at skabe friktion, der ruller oocytterne.

Flyt nu det øverste dias i en lille vinkel for at rulle oocytterne i en anden retning. Undgå cirkulær bevægelse, forøg denne vinkel i korte trin, indtil det øverste dias bevæger sig vinkelret på det nederste dias. Denne bevægelse fjerner mekanisk chorions og vitelline membraner, hvilket giver adgang til sonder eller pletter ind i oocytten.

Oocytter uden chorions vil fremstå lange og tynde, og dem uden vitelline membraner vil have spidse ender. For at adskille de ryddede oocytter fra de omkringliggende snavs, overføre prøveblandingen til et rør og tillade oocytterne at slå sig ned til bunden, mens snavset flyder øverst og kan fjernes.

I denne protokol vil vi fjerne chorion og vitellinmembraner fra modne Drosophila oocytter.

- For at adskille den sene fase oocytter, først, tilføje 1 milliliter PBSBTx til en lavvandet dissekere parabol. Derefter bruge en P200 med en BSA-belagt spids til at overføre faste æggestokke i den lave parabol. Pipette æggestokkene op og ned med BSA-belagt pipette spids til at løsne de modne oocytter fra de mindre modne oocytter.

Når sene oocytter er tilstrækkeligt adskilt, overføres alt væv til et mikrofugerør med 500 mikroliter. Fjern overskydende væske med en trukket Pasteur-pipette, så der efterlades ca. 150 til 200 mikroliter i røret.

For at forberede oocytrullende, forvæd en dyb brønd skål med 200 mikroliter PBSBTx. Dæk skålen og sæt den til side.

Få tre frostede glasrutsjebaner og sæt skub tre til side. Næste, gnid forsigtigt de matterede glasregioner på rutsjebaner en og to sammen. Skyl dem i deioniseret vand for at fjerne eventuelle glasskår og tør med en engangsservietter. Coat de matterede områder af dias en og to med PBSBTx ved at tilføje 50 mikroliter AF PBSBTx til det ene dias og gnide denne region med den anden dias. Fjern væsken med en engangs tørre og læg dias under et dissekerende mikroskop. Hold frostede områder af dias en og to i kontakt med slide tre støtte dias to.

At rulle oocytter, første, pre-våd en P200 pipette spids i PBSBTx og sprede oocytter i mikrofuge røret ved pipetter op og ned. Overfør 50 mikroliter af væske, der indeholder oocytter til midten af matteret glas del af dias en. Løft slide to til at gøre dette.

Langsomt lavere glide to, indtil overfladen spændingen af væsken skaber en forsegling mellem de to matterede glas regioner. Der bør være nok væske til at dække det matterede område, men ingen bør siver ud. Derefter holde den nederste dias en på plads med den ene hånd og bruge den anden hånd til at flytte den øverste dias to frem og tilbage i vandret retning, holde dias to niveau og understøttes på dias tre.

Udfør under et mikroskop for nem visualisering af oocyt bevægelser og fremskridt. Efter et par bevægelser i vandret retning, lidt ændre bevægelsesvinklen. I flere trin, gradvist øge denne vinkel til 90 grader, indtil bevægelsen af den øverste dias to er vinkelret på startretningen. Bemærk, at tomme chorions vil være synlige i væsken, og oocytter mangler chorions vises længere og tyndere.

- Når du ruller oocytterne, skal du sørge for, at rulleretningen altid er i en lige linje og aldrig en cirkulær bevægelse.

- Gentag rullen ca. 7 til 10 gange, indtil opløsningen bliver lidt overskyet. Stop med at rulle, når størstedelen af oocytterne ser ud til at have mistet deres vitellinmembraner.

Løft forsigtigt det øverste dias to, træk et af hjørnerne til midten af det matterede område i det nederste dias, så de rullede oocytter akkumuleres i midten af det matterede område. Skyl oocytterne fra begge dias med PBSBTx ind i deep-well skålen, der indeholder PBSBTx.

Rengør rutsjebaner et og to med ultrapure vand. Tør med engangstørring og nulstil. Gentag disse trin, indtil alle oocytter af samme genotype er rullet. Dette kræver normalt tre til fire runder rullende pr. Genotype.

Hvis du vil fjerne snavs efter rulning, tilsættes 1 milliliter PBSBTx til et 15-milliliter konisk rør.

Hold det koniske rør mod en mørk baggrund for at se de uigennemsigtige oocytter, når de synker. Efter at have ladet oocytterne slå sig ned til bunden, skal du bruge en P1000 til at fjerne de øverste 2 milliliter opløsning, der indeholder snavs og kasseres.

Efter at have gentaget trinnet for i alt tre runder af snavs fjernelse, skal du bruge en PBSBTx-belagt P1000 pipette spids til at overføre oocytter tilbage til den oprindelige 500-mikroliter mikrofuge rør. 20 til 25 hunner bør give ca 50 mikroliter af rullede modne oocytter.