Chorion und Vitelline Membran mechanische Entfernung: Eine Methode zur Vorbereitung Drosophila Oozyten für die direkte Beobachtung

- Beginnen Sie mit reifen Eizellen aus festen Eierstöcken in einer Kochlösung. Reife Eizellen tragen Eierschalen, die aus einer äußeren Chorion und einer inneren Vitellinemembran bestehen.

Um die Chorion- und Vitelline-Membran mechanisch zu entfernen, legen Sie die Eizellen zwischen die gefrosteten Teile zweier vorbehandelter Dias. Bewegen Sie den oberen Schlitten in geraden Hin- und Herbewegungen, um Reibung zu erzeugen, die die Eizellen rollt.

Bewegen Sie nun die obere Folie in einem leichten Winkel, um die Eizellen in eine andere Richtung zu rollen. Vermeiden Sie kreisförmige Bewegung, erhöhen Sie diesen Winkel in kurzen Schritten, bis sich der obere Schlitten senkrecht zum unteren Schlitten bewegt.

Oozyten ohne Sehnen erscheinen lang und dünn, und diejenigen ohne Vitelline-Membranen haben spitze Enden. Um die geräumten Eizellen von den umgebenden Trümmern zu trennen, übertragen Sie die Probenmischung in ein Rohr, und lassen Sie die Eizellen sich auf den Boden absetzen, während der Schutt oben schwimmt und entfernt werden kann.

In diesem Protokoll werden wir Chorion- und Vitelline-Membranen aus reifen Drosophila-Oozyten entfernen.

- Um die späten Eizellen zu trennen, fügen Sie zuerst 1 Milliliter PBSBTx zu einer flachen Sezierenderschale hinzu. Verwenden Sie dann eine P200 mit einer BSA-beschichteten Spitze, um feste Eierstöcke in die flache Schale zu übertragen. Pipette die Eierstöcke nach oben und unten mit der BSA-beschichteten Pipettespitze, um die reifen Eizellen von den weniger reifen Oozyten zu entfernen.

Wenn die Eizellen im späten Stadium ausreichend getrennt sind, übertragen Sie das gesamte Gewebe in ein 500-Mikroliter-Mikrofugerohr. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit mit einer gezogenen Pasteur-Pipette, so dass etwa 150 bis 200 Mikroliter im Rohr bleiben.

Zur Vorbereitung auf das Eizellenwalzen, vor-nass eine Tiefbrunnenschale mit 200 Mikroliter PBSBTx. Bedecken Sie die Schale und legen Sie sie beiseite.

Erhalten Sie drei Milchglasrutschen und stellen Sie Rutsche drei beiseite. Als nächstes reiben Sie die Mattglasbereiche der Rutschen eins und zwei vorsichtig zusammen. Spülen Sie sie in entionisiertem Wasser, um alle Glasscherben zu entfernen und trocknen Sie mit einem Einweg-Wischtuch. Beschichten Sie die mattierten Bereiche der Dias eins und zwei mit PBSBTx, indem Sie 50 Mikroliter PBSBTx zu einem Dia hinzufügen und diesen Bereich mit dem anderen Schieberegler reiben. Entfernen Sie die Flüssigkeit mit einem Einwegtuch und legen Sie die Dias unter ein Trennmikroskop. Halten Sie die frostigen Bereiche der Diaseder eins und zwei in Kontakt mit dem Schiebeschlitten.

Um die Eizellen zu rollen, zuerst eine P200 Pipettenspitze in PBSBTx vornass zu machen und die Eizellen im Mikrofugerohr zu zerstreuen, indem sie nach oben und unten pfeifen. Übertragen Sie 50 Mikroliter Flüssigkeit, die die Eizellen enthält, in die Mitte des Milchglasteils von Folie eins. Heben Sie rutsche zwei, um dies zu tun.

Langsam tiefer gleiten zwei, bis die Oberflächenspannung der Flüssigkeit eine Dichtung zwischen den beiden Milchglasbereichen schafft. Es sollte genug Flüssigkeit vorhanden sein, um den frostigen Bereich zu bedecken, aber keiner sollte aussickern. Dann halten Sie den unteren Schlitten eins an Ort und Stelle mit einer Hand und verwenden sie die andere Hand, um die obere Rutsche zwei hin und her in horizontaler Richtung zu bewegen, wobei gleiten zwei Ebenen und auf Folie drei unterstützt werden.

Führen Sie unter dem Mikroskop für eine einfache Visualisierung der Oozytenbewegungen und Fortschritt. Nach ein paar Bewegungen in der horizontalen Richtung, leicht ändern Sie den Winkel der Bewegung. In mehreren Schritten, schrittweise erhöhen Sie diesen Winkel auf 90 Grad, bis die Bewegung der oberen Folie zwei ist senkrecht zur Startrichtung. Beachten Sie, dass leere Kränzen in der Flüssigkeit sichtbar werden, und Oozyten ohne Kränetage werden länger und dünner erscheinen.

- Stellen Sie beim Rollen der Eizellen sicher, dass die Bewegungsrichtung immer in einer geraden Linie und niemals in einer kreisförmigen Bewegung erfolgt.

- Wiederholen Sie das Rollen etwa 7 bis 10 Mal, bis die Lösung leicht bewölkt wird. Hören Sie auf zu rollen, wenn die Mehrheit der Eizellen scheinen ihre Vitelline-Membranen verloren zu haben.

Heben Sie die obere Rutsche zwei vorsichtig an und ziehen Sie eine ihrer Ecken in die Mitte des frostigen Bereichs am unteren Schiebeschlitten, so dass sich die gerollten Eizellen in der Mitte des frostigen Bereichs ansammeln. Spülen Sie die Eizellen von beiden Dias mit PBSBTx in die Tiefbrunnenschale, die PBSBTx enthält.

Reinigen Sie die Gleitet eins und zwei mit Reinstwasser. Trocknen Sie mit einem Einweg-Wischtuch und setzen Sie diese Schritte zurück. Wiederholen Sie diese Schritte, bis alle Eizellen des gleichen Genotyps gerollt sind. Dies erfordert in der Regel drei bis vier Rollenrunden pro Genotyp.

Um Schmutz nach dem Walzen zu entfernen, 1 Milliliter PBSBTx zu einem 15-Milliliter konischen Rohr geben. Wirbeln Sie die Flüssigkeit, um die Seiten des Rohres zu beschichten. Mit einer PBSBTx-beschichteten P1000 Pipettenspitze die gerollten Eizellen von der Tiefbrunnenschale in das konische Rohr mit 1 Milliliter PBSBTx zu bringen. Fügen Sie weitere 2 Milliliter PBSBTx in das konische Rohr, das die Oozyten enthält.

Halten Sie das konische Rohr vor einem dunklen Hintergrund, um die undurchsichtigen Eizellen beim Sinken zu sehen. Nachdem Sie die Eizellen nach unten setzen lassen, verwenden Sie eine P1000, um die oberen 2 Milliliter Lösung zu entfernen, die Schmutz enthält und entsorgt.

Nach der Wiederholung des Schritts für insgesamt drei Runden der Schmutzentfernung, verwenden Sie eine PBSBTx-beschichtete P1000 Pipettenspitze, um die Eizellen zurück in das ursprüngliche 500-Mikroliter-Mikrofuge-Rohr zu übertragen. 20 bis 25 Weibchen sollten etwa 50 Mikroliter gewalzte reife Oozyten ergeben.