乔里翁和维泰琳膜机械去除：一种为直接观察准备 果蝇 卵母细胞的方法

- 从盐水溶液中固定卵巢的成熟卵母细胞开始。成熟的卵母细胞承担蛋壳， 包括外胆汁和内维特尔线膜。

要机械地去除胆汁和卵石膜，将卵母细胞放置在两个经过预处理的幻灯片的磨砂部分之间。 以直来回运动移动顶部滑梯，以产生摩擦，使卵母细胞滚动。

现在，以轻微的角度移动顶部滑梯，将卵母细胞向另一个方向滚动。避免圆形运动，以短增量增加此角度，直到顶部滑梯垂直于底部滑梯移动。此运动机械地去除胆汁和维特尔线膜，使探针或污渍能够进入卵母细胞。

没有胆汁的卵母细胞会显得又长又薄，没有胆碱膜的卵母细胞会有尖端。 要将清除的卵母细胞与周围的碎片分离，将样品混合物转移到管子上，让卵母细胞在碎屑漂浮在顶部时沉降到底部，然后被移除。

在此协议中，我们将从成熟的果蝇卵母细胞中去除胆汁和维他林膜。

- 要分离晚期卵母细胞，首先，在浅解剖盘中加入1 毫升 PBSBTx。 然后，使用带有 BSA 涂层尖端的P200 将固定卵巢转移到浅盘中。用BSA 涂层的移液器尖上上下下将卵巢移出较不成熟的卵母细胞。

当晚期卵母细胞充分分离时，将所有组织转移到一个500微升的微胶管中。用拉着的巴斯德移液器去除多余的液体，在管子里留下大约150到200微升。

为了准备卵母细胞滚动， 预湿一个深井菜与 200 微升的Pbsbtx.覆盖菜， 并放在一边。

获得三张磨砂玻璃滑梯，并将幻灯片放在一边。接下来，轻轻地将幻灯片的磨砂玻璃区域一和二擦在一起。在除离子水中冲洗它们，去除任何玻璃碎片，然后用一次性擦拭擦干。 将 50 微升 PBSBTx 添加到一张幻灯片中，并将此区域与另一张幻灯片摩擦，将幻灯片一号和二号滑梯的磨砂区域涂上 PBSBTx。 用一次性擦拭去除液体，并将幻灯片放在解剖显微镜下。保持幻灯片一和二的磨砂区域与幻灯片接触 三个支撑幻灯片二。

要滚动卵母细胞，首先，在PBSBTx中预湿P200移液器尖端，并通过上下管道分散微胶管中的卵母细胞。将含有卵母细胞的50微升液体转移到滑动器的磨砂玻璃部分的中心。抬起幻灯片两个来做到这一点。

缓慢地向下滑动两个，直到液体的表面张力在两个磨砂玻璃区域之间形成密封。应该有足够的液体覆盖磨砂区域，但不应渗出。然后，用一只手将底部滑梯一个放在原位，然后用另一只手将顶部滑梯向下移动两个水平方向，保持滑动两个级别，并在幻灯片三上支撑。

在显微镜下执行，以便于对卵母细胞运动和进度进行可视化。在水平方向进行几个运动后，稍微改变运动角度。 在多个增量中，将此角度逐渐增加到 90 度，直到顶部幻灯片二的运动垂直于起始方向。请注意，液体中将可见空的巧克力，而缺少胆汁的卵母细胞会显得更长更薄。

- 滚动卵母细胞时，确保滚动方向始终处于直线，且始终不呈圆形运动。

-重复滚动约 7 到 10 次， 直到溶液变得稍微多云。当大多数卵母细胞似乎失去了它们的膜时，停止滚动。

轻轻抬起顶部滑梯两个，将其中一个角拖至底部滑动处的磨砂区域中心，使卷起的卵母细胞积聚在磨砂区域的中心。用PBSBTx将两个滑梯中的卵母细胞冲洗到含有PBSBTx的深井盘中。

用超纯水清洁滑动一和二。用一次性擦拭和重置干燥。 重复这些步骤，直到所有相同基因型的卵母细胞都滚动。 这通常需要三到四轮滚动每个基因型。

要在滚动后清除碎屑，在 15 毫升圆锥管中加入1 毫升 PBSBTx。将液体旋转以涂抹管的两侧。 使用 PBSBTx 涂层的 P1000移液器尖端，将卷起的卵母细胞从深井盘转移到含有 1 毫升 PBSBTx 的圆锥管中。 向含有卵母细胞的圆锥管中再添加 2 毫升 PBSBTx。

将圆锥管对着黑暗的背景，在它们下沉时看到不透明的卵母细胞。让卵母细胞沉入底部后，使用P1000去除含有碎屑的2毫升溶液的顶部，然后丢弃。

在重复了总共三轮碎片清除的步骤后，使用PBSBTx涂层的P1000移液器尖将卵母细胞转移回原来的500微升微胶管。 20至25个雌性应产生大约50微升的卷成熟卵母细胞。