Rimozione meccanica della membrana corionica e vitellina: un metodo per preparare gli ovociti drosophila per l'osservazione diretta

- Iniziare con gli ovociti maturi provenienti da ovaie fisse in una soluzione salina. Gli ovociti maturi portano gusci d'uovo costituiti da un coro esterno e una membrana vitellina interna.

Per rimuovere meccanicamente il corore e la membrana vitellina, posizionare gli ovociti tra le parti smerigliate di due diapositive pretrattate. Spostare la diapositiva superiore con movimenti dritti avanti e indietro per creare attrito che fa rotolare gli ovociti.

Ora, spostate la diapositiva superiore con un leggero angolo per far rotolare gli ovociti in un'altra direzione. Evitando il movimento circolare, aumentare questo angolo con brevi incrementi fino a quando la diapositiva superiore non si sposta perpendicolarmente allo scivolo inferiore. Questo movimento rimuove meccanicamente i coriaci e le membrane vitelline, consentendo l'accesso per sonde o macchie nell'ovocita.

Gli ovociti senza corioni appariranno lunghi e sottili e quelli senza membrane vitelline avranno estremità appuntite. Per separare gli ovociti cancellati dai detriti circostanti, trasferire la miscela di campioni in un tubo e consentire agli ovociti di depositarsi sul fondo mentre i detriti galleggiano in alto e possono essere rimossi.

In questo protocollo, rimuoveremo le membrane corali e vitelline dagli ovociti maturi della Drosophila.

- Per separare gli ovociti in fase avanzata, in primo luogo, aggiungere 1 millilitro di PBSBTx a un piatto di sezionamento poco profondo. Quindi, utilizzare un P200 con una punta rivestita in BSA per trasferire ovaie fisse nel piatto poco profondo. Pipettare le ovaie su e giù con la punta della pipetta rivestita di BSA per spostare gli ovociti maturi dagli ovociti meno maturi.

Quando gli ovociti in fase avanzata sono sufficientemente separati, trasferire tutto il tessuto in un tubo di microfugo da 500 microlitri. Rimuovere il liquido in eccesso con una pipetta Pasteur tirata, lasciando circa 150-200 microlitri nel tubo.

Per prepararsi alla laminazione degli ovocite, pre-bagnare un piatto profondo con 200 microlitri di PBSBTx. Coprire il piatto e stergiarlo.

Ottenere tre scivoli di vetro smerigliato e mettere a parte lo scivolo tre. Successivamente, strofinare delicatamente le regioni di vetro smerigliato degli scivoli uno e due insieme. Risciacquarli in acqua deionizzata per rimuovere eventuali frammenti di vetro e asciugarli con una salvietta monouso. Rivestire le regioni smerigliate degli scivoli uno e due con PBSBTx aggiungendo 50 microlitri di PBSBTx a uno scivolo e strofinando questa regione con l'altra diapositiva. Rimuovere il liquido con una salvietta monouso e posizionare gli scivoli sotto un microscopio sezionante. Mantenere le regioni smerigliate degli scivoli uno e due a contatto con lo scivolo tre diapositive che supportano due.

Per arrotolare gli ovociti, in primo luogo, pre-bagnare una punta della pipetta P200 in PBSBTx e disperdere gli ovociti nel tubo di microfugo tubazioni su e giù. Trasferire 50 microlitri di liquido contenenti gli ovociti al centro della parte di vetro smerigliato dello scivolo uno. Sollevare lo scivolo due per fare questo.

Abbassare lentamente lo scivolo due fino a quando la tensione superficiale del liquido non crea una tenuta tra le due regioni di vetro smerigliato. Dovrebbe esserci abbastanza liquido per coprire l'area smerigliata, ma nessuno dovrebbe essere visualizzato. Quindi, tenere lo scivolo inferiore uno in posizione con una mano e utilizzare l'altra mano per spostare lo scivolo superiore due avanti e indietro in direzione orizzontale, mantenendo lo scivolo due livelli e supportato sullo scivolo tre.

Eseguire al microscopio per una facile visualizzazione dei movimenti e dei progressi degli ovociti. Dopo alcuni movimenti nella direzione orizzontale, modificare leggermente l'angolo di movimento. In incrementi multipli, aumentare gradualmente questo angolo a 90 gradi fino a quando il movimento della diapositiva superiore due è perpendicolare alla direzione iniziale. Si noti che i coriaci vuoti saranno visibili nel liquido e gli ovociti privi di corioni appariranno sempre più lunghi.

- Quando si arrotola gli ovociti, assicurarsi che la direzione di laminazione sia sempre in linea retta e mai in movimento circolare.

- Ripetere il rotolamento da 7 a 10 volte fino a quando la soluzione diventa leggermente torbide. Interrompere il rotolamento quando la maggior parte degli ovociti sembra aver perso le membrane vitelline.

Sollevare delicatamente lo scivolo superiore due, trascinando uno dei suoi angoli al centro della regione smerigliata nella parte inferiore dello scivolo uno in modo che gli ovociti arrotolati si accumulino al centro della regione smerigliata. Sciacquare gli ovociti da entrambe le diapositive con PBSBTx nel piatto profondo contenente PBSBTx.

Pulire gli scivoli uno e due con acqua ultrapura. Asciugare con una salvietta monouso e ripristinare. Ripetere questi passaggi fino a quando non sono stati arrotolati tutti gli ovociti dello stesso genotipo. In genere sono necessari da tre a quattro cicli di laminazione per genotipo.

Per rimuovere i detriti dopo la laminazione, aggiungere 1 millilitro PBSBTx a un tubo conico da 15 millilitri. Ruotare il liquido per rivestire i lati del tubo. Utilizzando una punta di pipetta P1000 rivestita con PBSBTx, trasferire gli ovociti laminati dal piatto profondo al tubo conico contenente 1 millilitro di PBSBTx. Aggiungere altri 2 millilitri di PBSBTx al tubo conico contenente gli ovociti.

Tenere il tubo conico su uno sfondo scuro per vedere gli ovociti opachi mentre affondano. Dopo aver lasciato depositare gli ovociti sul fondo, utilizzare un P1000 per rimuovere i primi 2 millilitri di soluzione contenenti detriti e scartare.

Dopo aver ripetuto il passo per un totale di tre cicli di rimozione dei detriti, utilizzare una punta di pipetta P1000 rivestita di PBSBTx per trasferire gli ovociti al tubo originale di microfugo da 500 microlitri. Da 20 a 25 femmine dovrebbero produrre circa 50 microlitri di ovociti maturi laminati.