絨毛膜およびビテリン膜の機械的除去:ショ ウジョウバエ 卵母細胞を直接観察するための調製方法

- 生理食類溶液中の固定卵巣からの成熟卵母細胞から始まる。成熟卵母細胞は、外側の絨毛膜と内なるビテリン膜からなる卵殻を持つ。

絨毛膜とビテリン膜を機械的に除去するには、前処理された2つのスライドの曇り部分の間に卵母細胞を置きます。

さて、上のスライドをわずかな角度で動かして卵母細胞を別の方向に転がします。円形の動きを避け、上のスライドが下のスライドに垂直に動くまで短い増分でこの角度を増やします。

長く薄い卵母細胞が現れ、ビテリン膜のない卵母細胞は端を尖っています。クリアされた卵母細胞を周囲の破片から分離し、サンプルミックスをチューブに移し、破片が上部に浮かび上がって取り除くことができる間、卵母細胞を底に落ち着かせることができます。

このプロトコルでは、成熟したショウジョウバエの卵母細胞から絨毛膜およびビテリン膜を除去する。

- 後期卵母細胞を分離するには、まず、PBSBTxの1ミリリットルを浅い解剖皿に加え、BSAコーティングされた先端を備えたP200を使用して、固定卵巣を浅い皿に移します。

後期卵母細胞が十分に分離されたら、すべての組織を500マイクロフュージチューブに移します。

卵母細胞の転がりに備えて、PBSBTxの200マイクロリットルで深い井戸皿を事前に濡らします。

3枚のすりガラススライドを手に入れ、スライド3枚を脇に置いて、次に、スライド1と2の曇ったガラス領域をそっとこすります。脱イオン水で洗い流し、使い捨てワイプで乾燥させます。PBSBTxでスライド1と2の曇り領域をコーティングし、PBSBTxを1つのスライドに50マイクロリットルを追加し、もう1つのスライドでこの領域をこすります。

卵母細胞を転がすために、まず、PBSBTxでP200ピペットチップを予め濡らし、ピペットチューブに卵母細胞を上下にピペットして分散させる。

液体の表面張力が2つの曇ったガラス領域の間にシールを作り出すまでゆっくりとスライド2を下げる。曇った領域を覆うのに十分な液体があるはずだが、どれも外に出るべきではない。その後、一方の手で下のスライドを所定の位置に持ち、もう一方の手を使って上のスライドを左右に前後に動かし、スライド2のレベルを維持し、スライド3でサポートする。

卵母細胞の動きや進行を顕微鏡で見やすくするために顕微鏡で行ってください。水平方向に数回動いた後、動きの角度を少し変えます。複数の増分で、トップスライド2の動きが開始方向に垂直になるまで、この角度を徐々に90度に増やします。

- 卵母細胞を転がすときは、回転の方向が常に直線であり、決して円形の動きでないことを確認してください。

- 溶液がわずかに曇るまで転がりを7~10回繰り返す。卵母細胞の大部分がビテリン膜を失っているように見えたら転がりを止める。

上のスライド2をそっと持ち上げ、その角の1つを下のスライド1の曇り領域の中央にドラッグして、ロールされた卵母細胞が曇った領域の中央に蓄積するようにします。

きれいなスライド1と2は超純水で1枚と2枚滑り、使い捨てワイプで乾いてリセットします。同じ遺伝子型のすべての卵母細胞が転がるまでこれらのステップを繰り返します。

転がった後に破片を取り除くには、15ミリリットルの円錐管に1ミリリットルのPBSBTxを加え、チューブの側面をコーティングするために液体を旋回します。

円錐形のチューブを暗い背景に持ち、不透明な卵母細胞が沈むのを見て、卵母細胞を底に落ち着かせ、P1000を使用して破片を含む溶液の上2ミリリットルを取り除き、廃棄します。

合計3ラウンドの破片除去のステップを繰り返した後、PBSBTxコーティングされたP1000ピペットチップを使用して卵母細胞を元の500マイクロラチンのマイクロフュージチューブに戻します。