Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Encyclopedia of Experiments
Encyclopedia of Experiments: Biology

A subscription to JoVE is required to view this content.

Korion og vitelline membran mekanisk fjerning

 
Click here for the English version

Korion og vitelline membran mekanisk fjerning: En metode for å forberede Drosophila Oocytes for direkte observasjon

Article

Transcript

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

- Begynn med modne oocytter fra faste eggstokkene i en saltløsning. Eldre oocytter bærer eggeskall som består av en ytre kor og indre vitellinemembran.

For å fjerne kor- og vitellinemembranen mekanisk, plasser oocyttene mellom de frostede delene av to forhåndsbehandlede lysbilder. Beveg det øverste lysbildet i rette frem og tilbake bevegelser for å skape friksjon som ruller oocyttene.

Nå flytter du det øverste lysbildet i en liten vinkel for å rulle oocyttene i en annen retning. Unngå sirkulær bevegelse, øk denne vinkelen i korte intervaller til det øverste lysbildet beveger seg vinkelrett på bunnskuffen. Denne bevegelsen fjerner mekanisk korionene og vitellinemembranene, noe som gir tilgang for sonder eller flekker inn i oocytten.

Oocytter uten chorions vil virke lange og tynne, og de uten vitelline membraner vil ha spisse ender. For å skille de ryddede oocyttene fra det omkringliggende rusk, overfør prøveblandingen til et rør, og la oocyttene slå seg ned til bunnen mens ruskene flyter toppen og kan fjernes.

I denne protokollen vil vi fjerne kor- og vitellinemembraner fra modne Drosophila oocytter.

- For å skille senfase oocytter, først, tilsett 1 milliliter PBSBTx til en grunn dissekeringsfat. Bruk deretter en P200 med en BSA-belagt spiss for å overføre faste eggstokkene til den grunne parabolen. Pipette eggstokkene opp og ned med BSA-belagt pipettespiss for å løsne de modne oocyttene fra de mindre modne oocyttene.

Når senfase oocytter er tilstrekkelig separert, overfør alt vevet til et mikrofugerør med 500 mikroliter. Fjern overflødig væske med en trukket Pasteur pipette, og la ca 150 til 200 mikroliter i røret.

For å forberede oocyttrulling, for våt en dyp brønnrett med 200 mikroliter PBSBTx. Dekk parabolen og sett den til side.

tre frostede glasssklier og sett skyve tre til side. Deretter gni forsiktig de frostede glassområdene med lysbilder en og to sammen. Skyll dem i deionisert vann for å fjerne glassskår og tørk med en engangsserviett. Belegge de frostede områdene med lysbilder en og to med PBSBTx ved å legge til 50 mikroliter PBSBTx til ett lysbilde og gni denne regionen med det andre lysbildet. Fjern væsken med en engangsserviett og legg lysbildene under et dissekeringsmikroskop. Hold de frostede områdene av lysbilder en og to i kontakt med lysbilde tre skyvestøtte.

For å rulle oocyttene, først, pre-wet en P200 pipettespiss i PBSBTx og spre oocyttene i mikrofugerøret ved å pipettere opp og ned. Overfør 50 mikroliter væske som inneholder oocyttene til midten av den frostede glassdelen av lysbilde en. Løft lysbilde to for å gjøre dette.

Senk sakte to til væskens overflatespenning skaper en forsegling mellom de to frostede glassområdene. Det skal være nok væske til å dekke det frostede området, men ingen skal siver ut. Hold deretter den nederste gliden på plass med den ene hånden og bruk den andre hånden til å flytte den øverste gliden to frem og tilbake i horisontal retning, hold lysbildet to nivåer og støttet lysbilde tre.

Utfør under et mikroskop for enkel visualisering av oocyttbevegelser og fremdrift. Etter noen bevegelser i horisontal retning, endre bevegelsesvinkelen litt. I flere trinn øker du gradvis denne vinkelen til 90 grader til bevegelsen av topplyset to er vinkelrett på startretningen. Merk at tomme chorions vil være synlige i væsken, og oocytter som mangler chorions vil virke lengre og tynnere.

- Når du ruller oocyttene, må du sørge for at rulleretningen alltid er i en rett linje og aldri en sirkulær bevegelse.

- Gjenta rullen ca. 7 til 10 ganger til oppløsningen blir litt overskyet. Slutt å rulle når de fleste oocytter ser ut til å ha mistet vitellinemembranene.

Løft forsiktig den øverste sklien to, dra et av hjørnene til midten av den frostede regionen nederst, skyv en slik at de rullede oocyttene akkumuleres i midten av den frostede regionen. Skyll oocyttene fra begge lysbildene med PBSBTx inn i dypbrønnfatet som inneholder PBSBTx.

Rengjør lysbildene en og to med ultrarent vann. Tørk med en engangsserviett og tilbakestill. Gjenta disse trinnene til alle oocyttene av samme genotype er rullet. Dette krever vanligvis tre til fire runder med rulling per genotype.

For å fjerne rusk etter rulling, tilsett 1 milliliter PBSBTx til et konisk rør 15 milliliter. Virvle væsken for å belegge sidene av røret. Bruk en PBSBTx-belagt P1000 pipettespiss, overfør de rullede oocyttene fra dypbrønnfatet til det koniske røret som inneholder 1 milliliter PBSBTx. Tilsett ytterligere 2 milliliter PBSBTx til det koniske røret som inneholder oocyttene.

Hold det koniske røret mot en mørk bakgrunn for å se de ugjennomsiktige oocyttene når de synker. Etter å ha latt oocyttene slå seg ned til bunnen, bruk en P1000 for å fjerne de øverste 2 milliliter oppløsningen som inneholder rusk og kast.

Etter å ha gjentatt trinnet for totalt tre runder med fjerning av rusk, bruk en PBSBTx-belagt P1000 pipettespiss for å overføre oocyttene tilbake til det originale 500-mikroliter mikrofugerøret. 20 til 25 kvinner skal gi ca. 50 mikroliter valsede modne oocytter.

Tags

Tom verdi Problem
Read Article

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter