Хорион и Vitelline Membrane Механическое удаление: Метод подготовки drosophila Oocytes для прямого наблюдения

- Начните со зрелых яйцеклеток из фиксированных яичников в солевом растворе. Зрелые яйцеклетки несут яичную скорлупу, состоящую из внешнего хориона и внутренней вителлиновой мембраны.

Чтобы механически удалить хорион и вителлиновую мембрану, поместите яйцеклетки между матовыми частями двух предварительно обработанных слайдов.

Теперь перемести верхнюю горку под небольшим углом, чтобы свернуть ооциты в другом направлении. Избегая кругового движения, увеличьте этот угол короткими шагами, пока верхний слайд не перейдет перпендикулярно нижней горке. Это движение механически удаляет хорионы и вителлиновые мембраны, обеспечивая доступ для зондов или пятен в яйцеклетку.

Ооциты без хорионов будут казаться длинными и тонкими, а те, у кого нет вителлиновых мембран, будут иметь заостренные концы. Чтобы отделить очищенные яйцеклетки от окружающего мусора, перенесите смесь образца в трубку, и позвольте яйцеклеткам осесть на дно, пока мусор плавает сверху и может быть удален.

В этом протоколе мы удалим хорионные и вителлиновые мембраны из зрелых ооцитов дрозофилы.

- Чтобы отделить поздних стадиях ооцитов, во-первых, добавить 1 миллилитр PBSBTx к мелкой рассечения блюдо. Затем, используйте P200 с BSA покрытием отзыв для передачи фиксированных яичников в мелкой блюдо. Pipette яичников вверх и вниз с BSA покрытием пипетки отзыв выбить зрелые яйцеклетки из менее зрелых ооцитов.

Когда поздние яйцеклетки достаточно разделены, перенесите всю ткань в 500-микролитровую микрофлотную трубку. Удалите лишнюю жидкость с вытянутой трубчатой трубой Pasteur, оставляя в трубке от 150 до 200 микролитров.

Чтобы подготовиться к прокатке яйцеклеток, предварительно промокнуть глубокое блюдо с 200 микролитров PBSBTx. Обложка блюдо и отложите его в сторону.

Получить три матовыми стеклянными горками и установить слайд три в сторону. Далее, аккуратно руб матовой стеклянной области слайдов один и два вместе. Промыть их в дейонизированной воде, чтобы удалить любые стеклянные осколки и высушить одноразовой салфеткой. Пальто матовыми областями слайдов один и два с PBSBTx, добавив 50 микролитров PBSBTx в один слайд и трения этой области с другой слайд. Удалить жидкость с одноразовой салфеткой и поместить слайды под рассечением микроскопа.

Чтобы свернуть ооциты, во-первых, предварительно мокрый наконечник P200 пипетки в PBSBTx и разогнать яйцеклетки в трубке микрофуза путем трубопроводов вверх и вниз. Передача 50 микролитров жидкости, содержащей ооцитов в центр матовой стеклянной части слайда один. Лифт слайд два, чтобы сделать это.

Медленно опустите слайд два, пока поверхностное натяжение жидкости не создаст уплотнение между двумя матовыми стеклянными областями. Там должно быть достаточно жидкости, чтобы покрыть матовую область, но никто не должен просачиваться. Затем, удерживайте нижнюю горку один на месте одной рукой и используйте другую руку, чтобы переместить верхнюю горку два вперед и назад в горизонтальном направлении, сохраняя слайд два уровня и поддерживается на слайде три.

Выполните под микроскопом для легкой визуализации движений и прогресса яйцеклеток. После нескольких движений в горизонтальном направлении, слегка измените угол движения. При множественных приращениях постепенно увеличивайте этот угол до 90 градусов, пока движение верхнего слайда два перпендикулярно исходному направлению. Обратите внимание, что пустые хорионы будут видны в жидкости, а ооциты, не имеющие хорионов, будут появляться длиннее и тоньше.

- При прокатке ооцитов, убедитесь, что направление прокатки всегда в прямой линии и никогда не круговое движение.

- Повторите прокатки около 7 до 10 раз, пока раствор становится немного облачно. Остановить прокатки, когда большинство яйцеклеток, как представляется, потеряли свои вителлин мембраны.

Аккуратно поднимите верхнюю горку два, перетаскивая один из ее углов к центру матовой области, в нижней слайде один так, чтобы свернутые яйцеклетки накапливались в центре матовой области. Промыть яйцеклетки с обоих горок с PBSBTx в глубокое блюдо, содержащее PBSBTx.

Чистые слайды один и два с ультрачистой водой. Сухой с одноразовой салфетки и сброса. Повторите эти шаги, пока все яйцеклетки одного и того же генотипа были свернуты. Это обычно требует от трех до четырех раундов прокатки на генотип.

Чтобы удалить мусор после прокатки, добавить 1 миллилитр PBSBTx в 15-миллилитровую коническую трубку. Вихрем жидкости, чтобы покрыть стороны трубки. Использование PBSBTx покрытием P1000 пипетки кончик, передача проката oocytes из глубокой хорошо блюдо конической трубки, содержащей 1 миллилитр PBSBTx. Добавить дополнительные 2 миллилитров PBSBTx в конической трубки, содержащей os.

Держите коническую трубку на темном фоне, чтобы увидеть непрозрачные яйцеклетки, как они тонут. После того, как позволить яйцеклетки оседают на дно, используйте P1000, чтобы удалить верхние 2 миллилитров раствора, содержащего мусор и выбросить.

После повторения шага в общей сложности три раунда удаления мусора, используйте PBSBTx покрытием P1000 пипетки отзыв для передачи ооцитов обратно в оригинальный 500-микролитер микрофьюдж трубки. 20 до 25 женщин должны дать около 50 микролитров проката зрелых яйцеклеток.