Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Encyclopedia of Experiments
Encyclopedia of Experiments: Biology

A subscription to JoVE is required to view this content.

Mekanisk borttagning av chorion- och vitelinmembran

 
Click here for the English version

Mekanisk borttagning av chorion- och vitelinmembran: En metod för att förbereda Drosophila-oocyter för direkt observation

Article

Transcript

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

- Börja med mogna äggceller från fasta äggstockar i en saltlösning. Mogna äggskal av oocyter bär äggskal bestående av en yttre korition och inre vitelinmembran.

För att mekaniskt ta bort chorion- och vitelinmembranet, placera äggcellerna mellan de frostade delarna av två förbehandlade diabilder.

Flytta nu den övre bilden i en liten vinkel för att rulla äggcellerna i en annan riktning.

Oocyter utan chorions kommer att verka långa och tunna, och de utan vitelina membran kommer att ha spetsiga ändar.

I detta protokoll kommer vi att ta bort chorion och vitelline membran från mogna Drosophila äggceller.

- För att separera de sena äggcellerna, tillsätt först 1 milliliter PBSBTx till en grund dissekeringsfat.

När sena äggceller är tillräckligt separerade, överför all vävnad till ett 500 mikroliter microfuge-rör. Ta bort överflödig vätska med en utdragen Pasteur-pipett och lämna cirka 150 till 200 mikroliter i röret.

För att förbereda för oocytvalsning, förtrulla en djupbrunnsskål med 200 mikroliter PBSBTx. Täck skålen och ställ den åt sidan.

tre frostade glasrutschbanor och ställ rutschkanan tre åt sidan. Skölj dem i avjoniserat vatten för att ta bort glasskärvor och torka med en engångsservett.

För att rulla äggcellerna, först, förfukta en P200 pipettspets i PBSBTx och sprida äggcellerna i mikrofugeröret genom att pipettera upp och ner. Överför 50 mikroliter vätska som innehåller äggcellerna till mitten av den frostade glasdelen av bild ett. Lyft skjut två för att göra detta.

Sänk långsamt två tills vätskans ytspänning skapar en tätning mellan de två frostade glasregionerna.

Utför under ett mikroskop för enkel visualisering av oocytrörelser och framsteg.

- När du rullar äggcellerna, se till att rullriktningen alltid är i en rak linje och aldrig en cirkulär rörelse.

- Upprepa rullen ca 7 till 10 gånger tills lösningen blir något grumlig. Sluta rulla när majoriteten av äggcellerna verkar ha förlorat sina vitelina membran.

Lyft försiktigt den övre bilden två och dra ett av dess hörn till mitten av det frostade området längst ner skjut en att de rullade äggcellerna ackumuleras i mitten av den frostade regionen. Skölj äggcellerna från båda bilderna med PBSBTx i djupbrunnsskålen som innehåller PBSBTx.

Rengör diabilder ett och två med ultrapurevatten.

För att ta bort skräp efter rullning, tillsätt 1 milliliter PBSBTx till ett 15 milliliter koniskt rör. Snurra vätskan för att täcka rörens sidor. Med hjälp av en PBSBTx-belagd P1000-pipettspets överför du de rullade äggcellerna från djupbrunnsskålen till det koniska röret som innehåller 1 milliliter PBSBTx. Tillsätt ytterligare 2 milliliter PBSBTx till det koniska röret som innehåller äggcellerna.

Håll det koniska röret mot en mörk bakgrund för att se de ogenomskinliga äggcellerna när de sjunker.

Efter att ha upprepat steget för totalt tre omgångar skräpborttagning, använd en PBSBTx-belagd P1000 pipettspets för att överföra oocyterna tillbaka till det ursprungliga 500-mikrolitermikrifugröret.

Tags

Tomt värde ärende
Read Article

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter