Eliminación mecánica de membranas de colina y vitellina: Un método para preparar ocitos de Drosophila para observación directa

- Comienza con ovocitos maduros de ovarios fijos en una solución salina.

Para eliminar mecánicamente la membrana de coral y vitellina, coloque los ocitos entre las partes esmeriladas de dos diapositivas pretratadas. Mueva la diapositiva superior en movimientos rectos hacia adelante y hacia atrás para crear fricción que enrolle los ocitos.

Ahora, mueva la diapositiva superior en un ángulo leve para rodar los ócitos en otra dirección. Evitando el movimiento circular, aumente este ángulo en incrementos cortos hasta que la diapositiva superior se mueva perpendicular a la diapositiva inferior.

Los ocitos sin coral aparecerán largos y delgados, y aquellos sin membranas vitellinas tendrán extremos puntiagudos. Para separar los ocitos despejados de los desechos circundantes, transferir la mezcla de muestra a un tubo y permitir que los ocitos se asienten hacia la parte inferior mientras los desechos flotan en la parte superior y se pueden retirar.

En este protocolo, eliminaremos las membranas de coral y vitellina de los ocitos maduros de Drosophila.

- Para separar los ovocitos en etapa tardía, primero, añadir 1 mililitro de PBSBTx a un plato diseccionador poco profundo. Luego, utilizar un P200 con una punta recubierta de BSA para transferir ovarios fijos en el plato poco profundo. Pipette los ovarios arriba y abajo con la punta de pipeta recubierta de BSA para desalojar los ovocitos maduros de los ovocitos menos maduros.

Cuando los ocitos en etapa tardía estén suficientemente separados, transfiera todo el tejido a un tubo de microcombustible de 500 microlitros. Retire el exceso de líquido con una pipeta Pasteur extraída, dejando alrededor de 150 a 200 microlitros en el tubo.

Para prepararse para la rodadura de ócitos, pre-moje un plato de pozo profundo con 200 microlitros de PBSBTx. Cubra el plato y reserve.

Obtenga tres toboganes de vidrio esmerilado y reserve tres. Enjuáguelos en agua desionizada para eliminar cualquier fragmento de vidrio y séquelos con una toallita desechable. Cubra las regiones esmeriladas de los toboganes uno y dos con PBSBTx añadiendo 50 microlitros de PBSBTx a un tobogán y frotando esta región con el otro tobogán. Retire el líquido con una toallita desechable y coloque los toboganes bajo un microscopio diseccionador.

Para enrollar los ocitos, primero, pre-mojar una punta de pipeta P200 en PBSBTx y dispersar los ocitos en el tubo de microcombustible pipeteando hacia arriba y hacia abajo.

Baje lentamente la diapositiva dos hasta que la tensión superficial del líquido cree un sello entre las dos regiones de vidrio esmerilado. Debe haber suficiente líquido para cubrir el área esmerilada, pero ninguna debe ser filtrada.

Actuar bajo un microscopio para una fácil visualización de los movimientos y progresos de los ocitos. Después de unos movimientos en la dirección horizontal, cambiar ligeramente el ángulo de movimiento. En múltiples incrementos, aumentar gradualmente este ángulo a 90 grados hasta que el movimiento de la diapositiva superior dos sea perpendicular a la dirección inicial.

- Al rodar los ocitos, asegúrese de que la dirección de la rodadura esté siempre en línea recta y nunca en un movimiento circular.

- Repita el balanceo unas 7 a 10 veces hasta que la solución se vuelva ligeramente turbia.

Levante suavemente el tobogán superior dos, arrastrando una de sus esquinas hasta el centro de la región helada en la diapositiva inferior para que los ocitos enrollados se acumulen en el centro de la región helada. enjuague los ocitos de ambos toboganes con PBSBTx en el plato de pozo profundo que contiene PBSBTx.

Limpie los toboganes uno y dos con agua ultrapura. Seque con una toallita desechable y restablezca. Repita estos pasos hasta que se hayan enrollado todos los ocitos del mismo genotipo.

Para eliminar los escombros después de rodar, añadir 1 mililitro PBSBTx a un tubo cónico de 15 mililitros. Arremolina el líquido para recubrir los lados del tubo. Usando una punta de pipeta P1000 recubierta de PBSBTx, transfiere los ocitos enrollados del plato de pozo profundo al tubo cónico que contiene 1 mililitro de PBSBTx.

Sujete el tubo cónico sobre un fondo oscuro para ver los ócitos opacos mientras se hunden. Después de dejar que los ocitos se asienten en la parte inferior, utilice un P1000 para eliminar los 2 mililitros superiores de solución que contienen residuos y se desechan.

Después de repetir el paso para un total de tres rondas de eliminación de residuos, utilice una punta de pipeta P1000 recubierta de PBSBTx para transferir los ocitos de nuevo al tubo de microfugio original de 500 microlitros.